全爱君，魏 巍，张师伟，蔡国锋,李世伟，尚莉莉

(黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

临床治疗过程中对于发病率、致残率和死亡率都比较高的缺血性脑卒中治疗最有效的方法就是及时恢复缺血区域的血液供应，挽救缺血半暗带，但缺血后的血液恢复会进一步导致组织损伤和功能障碍[1-2]。医药工作者普遍认为降低再灌注损伤是治疗缺血性脑卒中的关键因素[3-4]。脑缺血再灌注损伤机制并不明确，但主要与能量代谢障碍、线粒体损伤、氧化应激、钙超载、兴奋性氨基酸毒性和神经细胞凋亡有关[5-8]。

磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Serine /threonine kinase，Akt)信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，对于维持细胞的生存和抑制细胞凋亡起关键作用[9]，Akt是PI3K下游信号通路的主要靶点，处于中心环节，活化的Akt是发挥抗凋亡的关键作用，具有抑制多种刺激引起的细胞凋亡作用[10-11]。研究发现PI3K/Akt是促进细胞存活的重要信号通路，在脑缺血再灌注过程中能够减轻对神经细胞的损伤，促进神经元细胞存活作用[12-14]。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是在特定的缺氧条件下广泛存在的一种缺氧应答调控因子，通过转录及转录后的调控，使机体适应缺血或缺氧环境，同时研究证明HIF-1α在细胞凋亡过程中起着关键作用[15-16]。研究发现通过调控PI3K/AKT/HIF-1α信号通路能够减轻肺缺血再灌注损伤[17-18]。

研究表明,电针可以调控脑缺血再灌注大鼠海马CA1区的CREB及其磷酸化水平(p-CREB)的表达，减小梗死面积，改善认知功能。电针曲池、足三里穴，头针透刺百会、曲鬓穴治疗方法可调控炎症相关信号通路。另外还可以降低脑组织中缺血区的环氧化酶2(COX-2)并增强转化生长因子β1的表达[19-20]。本实验建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，给予重复电针预处理百会穴、曲鬓穴与神庭穴，探讨其对大鼠脑缺血再灌注损伤后的保护机制。研究是否通过调控PI3K/Akt/HIF-1α信号通路对脑缺血再灌注引起的细胞损伤起到保护作用。本研究采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，观察电针预处理对脑缺血再灌注损伤神经功能和脑梗死体积影响及对脑组织中p-Akt、Caspase-3和HIF-1α表达情况，探讨电针预处理治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

48只健康SD大鼠，体质量(240±10)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，实验前适应性饲养观察3 d。将大鼠完全随机分为假手术组、模型组、电针预处理组和LY294002组(2.5 μg/kg)。模型组、电针预处理组和LY294002组大鼠进行脑缺血再灌注模型制备。所有实验动物操作均符合实验动物伦理学要求。

1.2 药品及试剂

LY294002(美国Sigma公司);兔抗大鼠p-Akt多克隆抗体、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体及兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗体(爱必信公司);辣根酶过氧化物酶标记山羊抗兔(北京中杉金桥)。

1.3 脑缺血再灌注模型建立

将连续给药7 d的各实验组动物按照Longa线栓法改良制作大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型[11]。称量大鼠体质量并且按体质量给药。腹腔注射给予10%水合氯醛进行麻醉，颈前术区脱毛、消毒，沿颈部正中线切开皮肤，逐层分离暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉远心端后，在颈内动脉上距离颈总动脉分叉处约2 mm处做一切口，将备好的线栓经切口处插入大脑中动脉始端，栓塞大脑中动脉，造成局灶性脑缺血。缺血2 h后拔除栓线实施再灌注24 h。

1.4 干预方法

1.4.1 假手术组 大鼠使用与模型组相同的处理手段，但不插入线栓对大脑中动脉进行阻闭，不进行电针预处理。

1.4.2 模型组 大鼠进行模型制备，不给予电针干预，其他处理方法均与电针预处理组一致。

1.4.3 电针预处理组 造模前先进行电针干预，参照华兴邦等制定的《大鼠穴位图谱的研制》取穴，取百会穴、曲鬓穴和神庭穴，以0.40 mm×0.25 mm毫针，15°角针刺,斜刺进针2 mm，百会穴连正极，神庭穴连负极，连成一组，曲鬓穴连成一组，针刺后施以电针(电流0.3 mA,疏密波,疏波频率20 Hz,密波频率100 Hz);曲池、足三里穴，以0.40 mm×0.25 mm毫针，直刺进针，直刺2 mm，连电针，参数为：疏密波，刺激电流l～2 mA，频率2/15 Hz，波宽0.2～0.6 ms。通电10 min，留针不通电5 min，连续重复4次，共1 h，电针干预结束后观察30 min行造模手术。

1.4.4 LY294002组 尾静脉注射LY294002(2.5 μg/kg)。

1.5 神经行为学评分

按照Longa 5分制评分标准[11]进行神经功能缺失程度评分。0分:无神经功能缺失症状，活动正常;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:出现向对侧转圈;3分:行走时身体向偏瘫侧倾倒者;4分:不能自发行走，意识丧失者。其中选取评分为1～3分并且无蛛网膜下腔出血的实验动物进行实验。

1.6 脑梗死体积测定

取缺血再灌注后脑组织，-20 ℃冷冻30 min，去除小脑、低位脑干及嗅球，脑组织从额极向后做连续冠状切成5片，置于含2% TTC的磷酸盐缓冲液中，37 ℃恒温箱孵育染色30 min，置于4%多聚甲醛固定24 h后拍照。采用图像分析软件分析计算脑梗死体积百分比。

1.7 Western blot检测

取缺血侧大脑组织100 mg置于1 mL组织细胞裂解液中，超声细胞破碎仪低温匀浆。12 000 r/min 4 ℃离心15 min，取上清，取2 μL蛋白溶液利用Direct Detect Spectrometer-Sample Measuring红外微定量分析仪直接检测蛋白浓度，取相同蛋白进行上样经SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜上，转膜结束后，TBS-T洗膜2次，10 min/次，5%脱脂奶粉室温孵育2 h后，加入p-AKT、Caspase3和HIF-1α一抗工作液，4 ℃过夜， TBS-T缓冲液洗膜5次，10 min/次，加入二抗工作液，室温孵育1 h，TBS-T洗膜5次，10 min/次，采用ECL法显色。凝胶成像系统拍照并分析。

1.8 脑组织中SOD、MDA和ROS含量测定

取各组缺血侧大脑组织100 mg，置于1.5 mL离心管中，超声细胞破碎仪低温匀浆置于冰上静置10 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液待测，按照试剂盒说明书要求测定SOD、MDA和ROS含量。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 各组神经功能评分结果

如表1所示，假手术组未出现神经功能缺损，其余各组均出现不同程度的神经功能缺损。与假手术组比较，模型组出现明显的神经功能损伤；与模型组比较，LY294002组神经功能缺损明显加重，表明抑制PI3K/AKT通路的激活，能够加重神经功能缺损；与模型组比较，电针预处理组神经功能缺损情况明显减轻，表明电针预处理能够明显改善脑缺血再灌注引起的神经功能缺损。脑梗死体积测定结果显示假手术组脑组织未出现梗死病灶，其余各组均出现不同程度的梗死病灶。与模型组比较，LY294002组的梗死病灶体积明显增加(P<0.05),表明抑制PI3K/AKT通路的激活能够明显增加脑缺血再灌注损伤；与模型组比较，电针预处理组脑梗死病灶体积明显减少(P<0.05)，表明电针预处理能够改善脑缺血再灌注损伤。

表1 脑缺血再灌注神经功能缺损评分及脑梗死体积测定

2.2 电针预处理对脑缺血再灌注损伤脑组织中p-Akt、Caspase3和HIF-1α蛋白影响

如图1～2所示，脑组织中存在基础的p-Akt和HIF-1α分泌，脑缺血再灌注后p-Akt和HIF-1α表达明显增加；与假手术组比较，模型组脑组织中p-Akt和HIF-1α表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，电针预处理组脑组织中p-Akt和HIF-1α表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，LY294002组脑组织中p-Akt表达明显降低(P<0.05)；如图3所示，与假手术组比较，模型组脑组织中Caspase-3的表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，电针预处理组脑组织中Caspase-3的表达明显减少(P<0.05)；与模型组比较，LY294002组脑组织中Caspase-3表达明显增加(P<0.05)。见表2。

注：1.假手术组；2.模型组；3.电针预处理组；4.LY294002组。图1 脑缺血再灌注损伤脑组织中HIF-1α蛋白表达

注：1.假手术组；2.模型组；3.电针预处理组；4.LY294002组。图2 脑缺血再灌注损伤脑组织中p-Akt蛋白表达

注：1.假手术组；2.模型组；3.电针预处理组；4.LY294002组。图3 脑缺血再灌注损伤脑组织中Caspase-3蛋白表达

表2 电针预处理对脑缺血再灌注损伤脑组织中p-Akt、Caspase-3和HIF-1α蛋白影响

2.3 电针预处理对脑缺血再灌注损伤脑组织中SOD、GSH和MDA含量的影响

如表3所示，与假手术组比较，模型组脑组织内SOD、MDA和GSH水平差异均具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，电针预处理能够明显降低脑组织内MDA水平,差异具有统计学意义(P<0.05)，明显升高脑组织内SOD和GSH水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。表明脑缺血再灌注后机体发生氧化应激，电针预处理组能够明显减轻氧化应激。

表3 电针预处理对脑缺血再灌注损伤脑组织中SOD、GSH和MDA含量影响

3 讨论

脑缺血再灌注损伤病理学机制复杂，研究表明通过调控机体内转运蛋白表达能够明显改善缺血再灌注损伤，在此调控过程中PI3K/AKT信号通路具有重要的作用[21]。本研究发现预处理给予电针预处理后能够明显降低脑缺血再灌注对神经功能损伤，降低脑梗死体积百分比，说明电针预处理对脑缺血再灌注损伤具有保护作用；同时预处理给予PI3K/Akt通路抑制剂LY294002能够明显增加脑缺血再灌注对神经功能损伤，增加脑梗死体积，表明抑制PI3K/Akt通路的激活能够加重脑缺血再灌注损伤；本研究发现建立局灶性脑缺血再灌注模型能够明显增加p-Akt的表达，说明脑缺血再灌注能够激活PI3K/Akt转导通路；预处理给予电针预处理能够极显著增加p-Akt的表达，说明电针预处理能够在脑缺血再灌注过程中激活PI3K/Akt信号通路。该研究与先前各种组织缺血再灌注损伤研究结果一致[22-23]。

HIF-1α在缺血再灌注损伤疾病中具有重要的作用，研究表明HIF-1α与脑血管疾病具有十分密切的关系[24-25]。细胞内氧浓度在1%～3%轻度缺氧情况下HIF-1α的表达具有抑制细胞凋亡的作用[26-27]。研究发现在脑缺血状态下，HIF-1α能够通过调节Bcl2/Bax、TNFα通路及ERK1/2通路来抑制Caspase3活化，进而抑制Caspase级联反应扩大，减少神经细胞的损伤[28-29]。本研究发现在脑缺血再灌注过程中HIF-1α的表达明显高于假手术组，说明脑缺血再灌注过程中HIF-1α表达增加；预处理组给予电针预处理在脑缺血再灌注过程中HIF-1α的表达明显高于模型组，说明给予电针预处理能够进一步激活HIF-1α的表达。

Caspase-3是细胞凋亡的关键酶和执行者，细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经途径[30]。本研究发现给予电针预处理后脑缺血再灌注后Caspase-3表达明显低于模型组，说明电针预处理能够明显降低脑缺血再灌注损伤引起神经细胞的凋亡，这与任德启等人研究结果一致[31]；给予LY294002阻断PI3K/Akt通路的激活能够明显增加Caspase-3表达，说明阻断PI3K/Akt通路促使神经细胞凋亡，这与王耀伍等人研究结果相符合。综上所述电针预处理对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与通过激活PI3K/AKT信号通路、抑制Caspase-3表达有关。

已有大量研究证实脑缺血再灌注损伤时，脑组织内伴随着大量自由基的产生及介导的脂质过氧化是缺血再灌注损伤的重要发病机制[32]。SOD和GSH是机体固有的氧自由基清除剂，体现机体清除氧自由基能力，MDA是氧自由基引发脂质过氧化产物，反映机体过氧化程度。本研究发现模型组脑组织中SOD和GSH含量明显降低，MDA含量明显增加，电针预处理组能够明显增加脑组织中SOD和GSH表达，MDA含量明显降低，说明氧化应激参与脑缺血再灌注损伤疾病的发生发展，电针预处理组能够通过提高SOD和GSH含量、降低MDA含量抵抗氧化应激对脑缺血再灌注的损伤。

百会穴为诸阳之会，开窍醒神、振奋阳气;神庭穴清散头风、镇静安神;此二穴皆属督脉，提升阳气。百会穴其治疗功效从《黄帝内经》《针灸甲乙经》《针灸大成》记载可以改善脑组织供血；能提高机体的抵抗力，激活、调节机体免疫机制，增强机体的防卫功能。本研究证明了电针预处理百会穴、曲鬓穴和神庭穴能够有效减轻脑缺血再灌注损伤减轻氧化损伤等作用。分子水平结果显示，电针预处理可以通过激活PI3K/Akt信号通路从而抑制Caspase-3表达最终抑制细胞凋亡，并且升高SOD和GSH抗氧化活性以及降低MDA含量最终改善脑缺血再灌注损伤，对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。