张 立,郭孝静,高叶萌,李 季,王 璐,辛贵乐

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江省农垦总医院，黑龙江 哈尔滨 150088)

慢性低灌注性(CCH)认知功能障碍是指在长期且慢性的脑供血不足情况下，脑组织细胞代谢功能异常所引起的脑功能减退的一种临床表现。现代研究表明，白质对缺血缺氧等多种神经系统疾病损害密切相关，极易出现不可逆损伤。少突胶质细胞(OLGs)参与了髓鞘的形成，对于维持有髓神经纤维作用的发挥及认知功能具有重要作用[1]。CCH可造成OLGs损伤、白质完整性破坏(白质脱髓鞘)。大量实验研究表明CCH发生时会释放炎性因子[2]，尤其是肿瘤坏死因子-α、细胞白介素1会导致细胞内皮和OLGs的信号失调，最终导致OLGs的凋亡[3]。前期研究表明针刺联合康复法对非痴呆型血管性认知功能损害具有显著的治疗效果[4]。本实验主要探究针刺联合康复法对慢性低灌注大鼠学习记忆能力及胼胝体内少突胶质细胞的影响，阐明针刺联合康复法治疗慢性低灌注所致的学习记忆能力下降的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级8周龄Wistar雄性大鼠，体质量215～265 g，采购于黑龙江中医药大学药物安全性评价中心[合格证书编号：SYXK(黑)201,000,7]。适应性喂养1周后，进行Morris水迷宫训练，依据训练结果选择水平相近的Wistar大鼠30只作为研究对象，采用随机数字表法分为假手术组、模型组、针刺组、康复组及针康组(每组6只)。除假手术组外各组均采用双侧颈总动脉结扎(2-VO)制备慢性低灌注大鼠模型[5]。实验过程中各项操作均严格遵守动物伦理准则和指南的相关规定。

1.2 主要仪器和试剂

ZH-PT型动物实验跑台(徐州利华)；Morris水迷宫(上海欣软信息科技)；-80℃冰箱(日本SANYO公司)；匀浆机(德国IKA)；Olig2(北京博奥森)；PV6001试剂盒、DAB显色剂(北京中杉金桥)；苏木素 、伊红(碧云天生物技术)；浓度10%的水合氯醛(北京化工产)；多聚甲醛(北京市化学试剂研究所)；二甲苯(上海建贝邦工公司)；激光多普勒血流仪(LDF)；脱脂牛奶(完达山乳业)。

1.3 动物造模

1.3.1 慢性低灌注模型制备 各组大鼠造模前12 h禁食，造模前4 h禁水。采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉。麻醉成功后，大鼠取仰卧位放置并固定于手术台，颈前部皮肤行剃毛处理并进行常规消毒操作后，持眼科剪沿颈部前正中线划开皮肤，长度约2 cm，暴露颈部筋膜及皮下组织并进行钝性分离，向外拨开胸锁乳突肌，暴露一侧颈总动脉，用4.0结扎线永久性结扎颈总动脉的近端和远端，并用手术剪从中间剪断，同样方法操作另一侧，逐层缝合并消毒(注意不要触及迷走神经)。

1.3.2 假手术组 术前准备及麻醉操作同上，手术操作仅分离双侧颈总动脉，不结扎，不剪断。无明显行为学与异常体征。

1.3.3 造模成功标准 慢性低灌注模型动物行为学表现为大鼠反应迟钝，行为学出现异常，比如找不到平台或者表现出攀爬行为及沿着迷宫侧壁转圈，逃避潜伏期变长，游泳距离变长，学习记忆功能严重受损。体征上表现为同侧眼睑眼裂变小，瞳孔缩小，眼球内陷，皮毛失去光泽。同时能够发现慢性低灌注大鼠的寻找平台策略呈现为周围式和随机式，与正常大鼠的直线式寻找平台策略相比，慢性低灌注大鼠的游过路程明显延长，空间学习能力明显下降[6]。

1.4 干预方法

1.4.1 假手术组、模型组 仅进行同等程度的抓取，不做跑台及针刺处理。

1.4.2 康复组 造模成功后，康复组给予4周的跑台训练。跑台的每个通道可以独立控制，防止造成个别老鼠被夹的情况。放置大鼠于电动跑台内进行适度的运动，大鼠为逃避入口处的电击而不停地向前奔跑，能够有效提高训练效果。训练方案：坡度为 0°;训练时间：30 min/次，1次/d;训练速度：1～3 d为8 m/min，4～7 d为12 m/min，7 d后为15 m/min，1次/d[7]。

1.4.3 针刺组 造模成功后，给予针刺治疗，采用0.25 mm×25 mm无菌针灸针，参考大鼠穴位图谱[8],取百会穴及其左、右各旁开2 mm处针刺，快速捻转1 min，1次/d，每次针刺留针2 h。

1.4.4 针康组 在针刺治疗期间给予跑台训练1次/d，具体操作方案同针刺组、康复组。

治疗4周后，进行Morris水迷宫定位航行实验与空间探索测试，测试完成予以断头处死，获取脑组织标本。

1.5 标本取材及处理方法

大鼠完成学习记忆能力检测和定位航行实验后，给予腹腔注射麻醉(同造模麻醉)，行腹部切开术，剥离腹膜，剪断肋骨，暴露心脏，从心尖处注入4%多聚甲醛固定液300～400 mL进行灌注[9]。灌注完成后，剥离脑组织并修块，置于4 ℃中的4%多聚甲醛固定液中固定48 h。常规石蜡包埋，制备4～6 μm薄片，用于免疫组化检测。

1.6 指标检测

1.6.1 学习记忆能力检测 本实验采用Morris水迷宫试验对各组大鼠的空间学习能力和记忆能力进行检测[9]。治疗4周后，各组大鼠分别进行连续6 d的Morris水迷宫试验检测。实验时应选择光线均匀、安静的环境，保持水温与室温相同(20～24 ℃)，倒入脱脂牛奶，以保证水为不透明的乳白色，同时确保避光、安静的环境中周围参照物的一致性。

1.6.1.1 定位航行实验 具体操作如下：以水池的4个象限为入水点，随机放入面向水池池壁的大鼠，摄像机跟踪拍摄。计算大鼠寻找平台所需要的时间、游泳的距离及其行为学的改变。如果大鼠在60 s内无法找到平台，则需要记录成绩为60 s。逃避潜伏期的试验2次/d，2次间隔4 h。最后取平均值作为大鼠此次逃避潜伏期试验的数据结果。

1.6.1.2 空间探索试验 在定位航行实验结束后，撤去水池内平台，随机选取水池任意一个象限作为入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录60 s内大鼠在游泳过程中经过平台的次数。

Chalker等[22]提出测量界面结合性能需要有准确的模型参量。考虑到实际服役环境的复杂多变，测量方法还需符合工况，即涂层和基体在界面处的分离并非瞬时破坏，而是较长时间内作用的结果[23]。杨班权等[24]根据脆韧性材料断裂行为不同将涂层和基体划分为脆性和韧性并相互组合形成四大类。不同的测试方法、力学模型、计算方法之间均会产生一定的误差，但是如果误差不大，则可以认为是准确的，Zhang等[25]采用基体侧面压入法和垂直拉伸法两种方法测量Al2O3/Al 6061基体界面结合的拉伸强度，发现测试结果在误差范围内。

1.6.2 HE染色 取大鼠脑组织经常规石蜡包埋，切片厚6 μm，二甲苯脱蜡两次，每次5 min；经无水乙醇5 min×2次，90%乙醇、80%乙醇和70%乙醇各5 min，使用双蒸馏水浸5 min，再经苏木素复染5 min，自来水冲洗；使用含1%盐酸的70%乙醇中分化20 s，蒸馏水浸5 min，70%、80%乙醇各5 min；之后经90%伊红醇溶液5 min，无水乙醇5 min×2次；再经二甲苯5 min×2次；最后在显微镜下观察其中性树胶封片。

1.6.3 ELISA检测 将切片置于4 ℃预冷的PBS溶液中制备10%脑组织匀浆，3 000 r/m，10 min，离心取上清，置于-20℃冰箱中保存。考马斯亮蓝法蛋白定量后，ELISA法检测组织匀浆中TNF-α、IL-1β蛋白含量，并最终计算出每毫克脑组织中TNF-α、IL-1β的含量。

1.6.4 免疫组化 切片常规脱蜡到水；后放入3% H2O2中孵育10 min，PBS冲洗3次，每次2 min；切片入构橡酸盐缓冲液(PH6)，后置于微波炉中加热2次，每次5 min，中间间隔10 min。自然冷却至室温后，加入一抗，放入4 ℃冰箱中孵育过夜，次日取出，PBS冲洗3次，每次3 min；加入二抗，放入37 ℃恒温箱中留置35 min，PBS冲洗3次，每次3 min；DAB显色6～10 min，冲洗干净后；苏木素复染2 min；常规脱水透明，封片处理完成后，400倍显微镜下观察并拍照。采用IPP6.0图像软件分析计算OLGs阳性细胞数，取3个视野的均值作为该样本的OLGs阳性细胞数的相对表达量[10]。

1.6.5 脑血流检测 给予腹腔注射麻醉(同造模麻醉)，麻醉成功后，大鼠俯卧位放置于手术台，头部皮肤剃毛处理并进行常规消毒操作后，用外科剪刀在头盖骨上的皮肤上做1个椭圆形的切口约2 cm暴露出颅骨,用棉签去除结缔组织，确保头盖骨清洁和干燥。将激光多普勒血流仪的探头用胶水固定于颅骨上，监测大鼠的脑血流(CBF)变化。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠学习记忆能力比较

通过Mrioss水迷宫检测各组大鼠行为学变化，与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，搜索原平台次数显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针刺组、康复组和针康组大鼠逃避潜伏期显著缩短，搜索原平台次数显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)；与针刺组和康复组比较，针康组大鼠逃避潜伏期显著缩短，搜索原平台次数显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1～2。

表1 各组大鼠逃避潜伏期结果比较

表2 各组大鼠搜索原平台区次数结果比较

2.2 各组大鼠HE染色结果比较

假手术组大鼠脑白质形态无异常。模型组大鼠脑白质肉眼可见脑部不同程度萎缩，显微镜下可观察到其胼胝体、脑室旁和皮质下白质疏松、纤维排列凌乱，胼胝体可见明显的空泡样改变，皮质下白质出现软化灶等病理性改变；与模型组比较，针刺组、康复组和针康组脑白质神经纤维排列紧密，胼胝体空泡面积明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)；与针刺组、康复组相比，针康组神经纤维排列更为规则，病理学改善更为显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠脑白质形态改变(200×)

2.3 各组大鼠脑组织内TNF-α、IL-1β水平比较

ElISA法检测结果显示[11]：与假手术组相比，模型组诱导了促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β表达增加,差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，各治疗组TNF-α、IL-1β水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；与针刺组、康复组相比，针康组大鼠脑组织内TNF-α、IL-1β水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠TNF-α、IL-1β检测结果比较

2.4 各组大鼠胼胝体部位OLGs的阳性表达情况比较

表4 胼胝体区Olig2阳性表达积分光密度

图2 各组大鼠OLGs表达情况(200×)

2.5 各组大鼠脑血流量结果比较

通过LDF检测各组大鼠脑血流量变化，与假手术组比较，模型组大鼠脑血流量显著减少，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，各治疗组大鼠脑血流量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；与针刺组和康复组相比，针康组大鼠脑血流量增加最明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠脑血流量

3 讨论

慢性脑灌注不足(CCH)是由于慢性神经退行性变亦或是脑血管疾病而产生的血液供应不足从而导致的认知障碍、情绪障碍和解决问题的能力丧失[12]。CCH所引起的脑组织血流降低、脑组织供血不足的病理状态是血管性痴呆和阿尔兹海默病等疾病的病理基础。关于CCH引起认知功能障碍的许多潜在机制，如神经元损伤、微血管病变、白质损伤和炎性反应。近年来，由CCH致认知障碍比例渐增，但对其发病机制、防治方法的研究等尚不成熟。

据报道，脑白质损伤(WML)影响学习记忆功能。脑白质占人脑质量的50%，在人脑中占据相当大的比例，主要由轴突纤维、少突胶质细胞和其他神经胶质细胞组成[11]。OLGs是构成白质的主要细胞类型，长期围绕着神经元的轴突形成髓鞘，特别易受到缺血性等多种神经系统疾病的损害，髓鞘有助于加速沿轴突传递的电信号，如果无少突胶质细胞，动作电位的速度会慢很多。据报道，在2-VO大鼠模型中，脑血流量仅达到正常值的1/3，阻塞双侧颈总动脉可在实验动物中诱发慢性脑灌注不足，大鼠会出现白质完整性破坏、OLGs损伤和白质脱髓鞘(髓鞘密度降低)，诱发神经元之间的传递障碍，导致认知障碍持续存在[13]。认知功能的恢复依赖于神经元之间电信号的传递，OLs是神经元通信所必须的最相关的细胞类型。已有文献表明，少突胶质细胞的形成可以促进认知功能的恢复[14]，新生的少突胶质细胞的数量与学习记忆功能呈正比[15]。此外，炎性因子在CCH诱导的WML的进展中起着至关重要的作用，从而造成脑损伤，脱髓鞘诱导CCH可能会损坏不仅白质还会增加炎性因子的释放。文献表明通过调节神经胶质细胞和炎性细胞因子表达，在CCH诱导的WML和认知障碍的发展中起保护作用[16]。当慢性脑低灌注发生时，大脑循环中持续的葡萄糖和氧气供应减少，LDF检测显示血流异常，大脑皮层脑血流量减少，导致了大脑蛋白质合成减弱，从而促进了缺血性损伤。神经活动和局部脑血流量之间的密切时空关系被称为“神经血管耦合”[17]。目前研究表明学习记忆能力提高可能是由神经耦合所需的局部脑血流量(CBF)的适当增加所决定的。

现代医学对治疗慢性低灌注认知功能障碍并无明确有效的治疗方法。目前，药物治疗有盐酸多奈哌齐、美金刚、丁苯酞[18]和尼莫地平等，这些药物在使用过程中对于认知功能障碍的改善，但疗效并不理想，这是由于这些药物在使用时急性脑梗死已经发生，患者认知功能已经下降或者加重。而中医学在治疗认知障碍拥有不可逾越的优势。申伟等[19]概括总结出中药改善认知功能具有绝对优势，对改善行为能力有明显的作用。另外，针灸治疗具有操作简单、副作用小和适用范围广范等特点，针灸在改善脑供血、保护及修复受损脑组织损伤等方面具有独特优势。除此之外，随着康复医学的快速发展，康复训练在慢性低灌注认知功能障碍方面的疗效逐渐引起关注。目前，较为有效的认知训练包括注意力、记忆力、定向力和逻辑思维等训练。有针对性的康复训练包括有氧运动是促进认知功能恢复的有效策略[20]，有氧运动能对认知功能方面做出明显的改善，有效增强大鼠的空间学习记忆能力。由于计算机辅助认知训练等仪器局限于医院，且花费巨大，给患者及家庭造成较大的经济压力，而有氧运动弥补了场地限制的缺点，且安全、简便和有效。故在本研究中采用ZH-PT型动物实验跑台来代替有氧运动康复。中医学针灸与康复的结合可以产生最大化的治疗功效，且二者有疾病治疗的交集。由此，郑婷婷等[21]提出了针康法的治疗理念，即头穴丛刺长留针同时伴有现代康复治疗，以使治疗达到最优化及最大化的效果。本实验结果显示，针刺联合康复法能够增加CCH大鼠认知功能障碍后胼胝体部OLGs标志物的表达，使脑白质完整性增加，排列更加紧密。

本项研究表明，Morris水迷宫显示，各治疗组大鼠学习记忆能力均有提高，且针康组大鼠改善最明显；HE染色后，各治疗组大鼠脑白质损伤改善，针康组大鼠脑白质改善较为明显；ELISA测定结果显示，各治疗组的TNF-α、IL-1β水平均有下降，针康组下降尤其显著；免疫组化结果表明各治疗组OLGs的阳性标志物表达均增加；激光多普勒血流仪测定结果显示，各治疗组的脑血流量均有增加，针康组增加最明显。

综上所述，针刺联合康复法(针康法)能够显著提高CCH大鼠认知功能障碍后胼胝体内OLGs标志物表达，减少大鼠脑组织内TNF-α、IL-1β水平，这可能是针刺联合康复法改善CCH大鼠认知功能障碍的部分作用机制。除此之外，针刺联合康复法的治疗效果明显优于单纯的针刺或者康复治疗，这为针刺联合康复法治疗认知功能障碍临床应用提供了理论支撑，具有良好的社会效益。