程亮亮 田毅 谭义文 王丹

(中南大学湘雅医学院附属海口医院麻醉科,海南 海口 570208)

术后神经认知功能障碍(Post-operative neurocognitive dysfunction，PNCD)是老年麻醉手术后常见的中枢神经系统并发症，具有记忆受损、认知功能异常等表现，影响疾病恢复进程，甚至会发展为老年痴呆，严重影响患者的生活质量[1]。目前，临床尚无有效防治PNCD的手段，部分药物通过减轻全身炎症或营养神经治疗效，但果仍不理想[2-3]。临床研究表明，临床常用吸入麻醉药物，如七氟醚、氟烷等，具有诱导迅速、无明显蓄积、苏醒快等优点，但高浓度药物仍会对中枢神经功能造成损伤，尤其是老龄人群广泛存在脑组织功能退化，麻醉术后PNCD发生风险较高[4-5]。动物实验研究发现[6-7]，七氟醚吸入麻醉可能通过激活海马神经元自噬引起海马神经元损伤，具有一定神经毒性作用。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)属于高选择性α2肾上腺素能受体(α2 adrenergic receptor，α2-AR)激动剂，具有镇静、镇痛作用，常于老年患者麻醉诱导前用药，以稳定诱导过程中血流动力学，辅助全身麻醉[8-9]。近年来，有报道认为DEX可预防老年非心脏手术患者术后PNCD发生风险，但具体影响机制尚不明确[10]。鉴于此，本研究在七氟醚麻醉下采用肝叶部分切除术建立PNCD大鼠模型，模拟腹腔术后神经功能损伤，观察不同剂量DEX通过自噬信号通路磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)对老年PNCD大鼠神经功能的影响，为DEX临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 右美托咪定(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20090248，规格2 mL:200 μg，批号：10081435)，七氟醚(湖北广奥生物科技有限公司，批号：6120104)，逆转录试剂盒(日本Takara公司，批号：D31145791)，兔抗大鼠磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)单抗(批号：ab11362)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)单抗(批号：ab12054)、磷酸化Akt(phosphorylation of Akt，p-Akt)多抗(批号：ab37159)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)单抗(批号：ab60218)、自噬标记蛋白Beclin-1(批号：ab55140)、微管相关蛋白轻链3(light chain 3，LC3，批号：ab12194)(一抗，美国Abcam公司)，山羊抗兔PI3K(批号：ab13446)、Akt(批号：ab20137)、p-Akt(批号：)、mTOR(批号：ab32194)、Beclin-1(批号：ab01510)、LC3(批号：ab00120)(二抗，美国Abcam公司)。

1.2 主要仪器 CM-120型透射电镜(荷兰PHILIPS公司)，Morris水迷宫及其配套图像采集分析系统(北京微信斯达科技发展有限责任公司)，3550UV酶标仪、7000实时荧光定量PCR仪、电泳仪、CheniDoc XRS化学发光成像分析系统(美国Bio-rad公司)。

1.3 实验动物 SPF级雄性SD大鼠50只，18月龄，体质量(600±100)g，购自南京大学模式动物研究所，许可证号：SCXK(苏)2018-0001，饲养条件：室温(24±1)℃，60%湿度，12 h/12 h昼夜节律照明，2只/笼饲养，自由饮水和进食。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及干预 采用随机数表法将50只SD大鼠分为5组：对照组、模型组、DEX低、中、高剂量组5组。模型组吸入3%七氟醚麻醉；DEX低、中、高剂量组分别预先腹腔注射25、50、100 μg/kg右美托咪定(按照人与动物体表面积换算法换算临床等效剂量为6.3 μg/kg，DEX低、中、高剂量分别约为4倍、8倍、16倍临床等效剂量)，30 min后3组均吸入3%七氟醚麻醉。各组大鼠麻醉后，参照文献[11]均进行部分肝叶切除术，建立PNCD大鼠模型，Morris水迷宫试验检测结果与对照组相比差异显著，即为建模成功。对照组大鼠腹腔注射生理盐水2 mL/kg，持续麻醉2 h(手术均结束)。

1.4.2 修正神经功能缺损程度(neurological severity score，NSS)评估 术后1、3、7 d采用NSS评分量表[12]对各组大鼠神经功能缺损程度进行评估，包括提尾、行走、感觉、平衡、反射5个试验内容，每个试验评分3、3、2、6、4分，总分18分，分数越高提示神经功能缺损越严重。

1.4.3 认知功能评估 采用Morris水迷宫试验[13]对各组大鼠认知功能进行评估：水迷宫直径1.5 m、水深0.75 m、控制水温(25±1)℃，将水池分为4个象限，安全岛置于第I象限，水下1 cm，宫体正上方摄像头可记录运动轨迹，固定4各入水点和固定实验时间。术后第7 d开始进行适应性训练1次，实验分两部分：①术后第8～11 d定位巡航试验，随机选取某1象限入水点，大鼠面对宫壁轻放入池，开始计时，记录60 s内找到并登陆安全岛的时间，即逃避潜伏期；若60 s内未找到安全岛，由实验者引导大鼠至安全岛，并停留30 s，逃避潜伏期记录为60 s。每个象限入水1次/d，共入水4次/d，每次间隔2 h。②术后第12 d进行空间探索试验，撤去安全岛，随机选择入水点，记录60 s内的游泳轨迹，统计目标象限游泳距离占比，即大鼠在目标象限(第I象限)内的游泳距离/总游泳距离×100%。

1.4.4 海马神经元超微结构观察 水迷宫试验结束后，立即处死各组大鼠，冰冻手术台迅速取出脑组织，取左侧海马组织，修整为边长为1 cm的组织块，放置于4%戊二醛中固定4 h，然后放置1%锇酸固定30 min，脱水后树脂包埋，制作厚度为50 nm切片，进一步醋酸双氧铀、枸橼酸铅双染色，透射电镜下观察、拍照，计数自噬小体数目。

1.4.5 海马PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA检测 水迷宫试验结束后，处死大鼠后取部分右侧海马组织，剪碎后提取组织中取总核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)含量，逆转录法获得互补链脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，经鉴定后进行实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)，反应体系：Taq酶 11.5 μL，上下游引物各1.0 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL；反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重复35个循环。以β-actin为管家基因，2-△△CT为目的基因的相对表达强度，重复3次取Ct平均值。引物序列，见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.6 海马PI3K、pAkt、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3-II、LC3-I蛋白检测 水迷宫试验结束后，处死大鼠后取部分右侧海马组织，加入液氮研磨，加入细胞裂解液，沸水浴8～10 min，12000 r/min离心15 min，取上清液，蛋白定量后，取40 μg样品于上样缓冲液混匀，沸水浴3 min，再次离心收集上清液，然后十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳，电转仪转膜60 min，加入封闭液摇床2 h(室温)，洗涤后加入一抗(1∶1000)，摇床孵育过夜(4℃)，洗涤后二抗(1∶8000)，孵育60 min(常温)，暗室中曝光，并于凝胶成像系统中扫描，进行灰度值分析，以目的蛋白与内参β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 大鼠神经功能缺损程度对比 术后50只大鼠均存活。DEX各剂量组NSS评分术后3 d、7 d均低于模型组，其中DEX低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仍高于对照组(P<0.05)；DEX各剂量组术后NSS评分均随时间的延长而降低(P<0.05)，模型组术后7 d较术后3 d稍有降低，但较术后1 d仍较高(P<0.05)，而对照组无明显变化，见表2。

表2 NSS评分对比Table 2 Comparison of NSS scores

2.2 逃避潜伏期、目标象限游泳距离占比对比 DEX各剂量组术后9～11 d逃避潜伏期均短于模型组，其中DEX低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仍长于较对照组(P<0.05)；对照组、3剂量组逃避潜伏期随时间而缩短(P<0.05)，而模型组无明显变化。DEX各剂量组目标象限游泳距离占比均高于模型组，其中DEX低剂量组<中剂量组<高剂量组，但仍低于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 逃避潜伏期、目标象限游泳距离占比对比Table 3 Comparison of escape latency and target quadrant swimming distance

2.3 海马神经元超微结构观察 透射电镜观察结果显示，对照组未观察到自噬小体，模型组自噬小体广泛存在(8.20±0.94)个/视野，形态多样化，可见双层膜包裹的颗粒状细胞质或退化细胞器。DEX各剂量组自噬小体数量减少，DEX低、中、高剂量组分别为(5.58±0.50)个/视野、(4.22±0.37)个/视野、(2.07±0.24)个/视野；DEX各剂量组自噬小体数目均少于模型组，其中DEX低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仍多于对照组(P<0.05)，见图1。

图1 透射电镜下海马神经元超微结构图片(×12 K)Figure 1 Ultrastructural picture of hippocampal neurons under transmission electron microscopy注：Ly.溶酶体；M.线粒体；N.细胞核；红色箭头为自噬小体

2.4 海马PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA表达对比 DEX各剂量组PI3K、mTOR mRNA相对表达量均高于模型组，其中DEX低剂量组<中剂量组<高剂量组，但仍低于对照组(P<0.05)；DEX各剂量组Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量均低于模型组，其中DEX低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仍高于对照组(P<0.05)，Akt mRNA相对表达量组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量对比Figure 2 Comparison of relative expressions of PI3K,Akt,mTOR,Beclin-1 and LC3 mRNA

2.5 海马PI3K、mTOR、Beclin-1蛋白表达及pAkt/Akt、LC3-II/LC3-I对比 DEX各剂量组PI3K、mTOR蛋白相对表达量、pAkt/Akt均高于模型组，其中DEX低剂量组<中剂量组<高剂量组，但仍低于对照组(P<0.05)；DEX各剂量组Beclin-1蛋白相对表达量、LC3-II/LC3-I均低于模型组，其中DEX低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仍高于对照组(P<0.05)，见图3。

图3 海马PI3K、Akt、pAkt、mTOR、Beclin-1、LC3-I、LC3-II蛋白表达(n=4，Figure 3 Expressions of PI3K,Akt,pAkt,mTOR,Beclin-1,LC3-I and LC3-II in hippocampus 注：与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05；与DEX低剂量组比，③P<0.05；DEX中剂量组比，④P<0.05注：与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05；与DEX低剂量组比，③P<0.05；DEX中剂量组比，④P<0.05

3 讨论

中枢神经功能损害属于麻醉手术后常见并发症，临床多表现为记忆、学习、认知功能异常等，可能持续数月甚至更长时间[14-15]。动物实验表明[16-17]，麻醉及手术应激可引起PNCD，其多能自行恢复，但对神经系统仍会造成一定损伤。PNCD发生机制复杂，涉及多种蛋白质表达及信号通路调控作用，最终可引起海马神经元细胞死亡。DEX属于美托嘧啶的异构体，其作用机制为通过激动脑脊髓中α2-AR而发挥镇静、止痛和抗交感作用，且已有研究证实DEX对多种脑损伤具有神经保护作用[18-20]。

水迷宫定位巡航和空间探索实验可评估大鼠的学习、记忆功能。寻找休息场所是动物本能，该过程可反应出大鼠对复杂信息的采集、整合和学习能力，寻找目标象限完成度与海马区结构和功能、中枢神经功能损害等关系密切[21]。本研究采用麻醉下行部分肝叶切除术法制备PNCD大鼠模型，模拟临床剖腹手术对机体神经功能的影响，术后采用水迷宫实验检测发现，逃避潜伏期长于对照组，目标象限游泳距离占比短于对照组，提示麻醉下行部分肝叶切除术法制备PNCD成功。DEX可有效抑制交感神经兴奋，激活突触前膜α2-AR(α1∶α2=1∶1600)[22]，继而负反馈抑制突触后膜兴奋，降低交感神经兴奋性。魏晓等[23]研究发现，麻醉前应用DEX有助于维持围术期血流动力学稳定，降低PNCD发生率，与本研究结果相似。本研究对PNCD大鼠术前应用不同剂量DEX干预，术后NSS评分低于模型组，逃避潜伏期均短于模型组，但仍长于对照组，目标象限游泳距离占比均高于模型组，但仍低于对照组，且均具有剂量依赖性，由此可知，DEX对减轻老年大鼠PNCD神经功能损伤有积极意义。

动物实验发现，老年大鼠术后海马部位常出现萎缩、体积减小现象[24]，进一步研究显示可能与海马神经元死亡有关。自噬是海马神经元主要死亡形式，本研究中透射电镜显示模型组自噬小体广泛存在，七氟醚麻醉下行肝叶切除术后大鼠海马神经元确有损伤。自噬属于Ⅱ型程序性细胞死亡，Beclin-1、LC3均属于自噬调控蛋白，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大、Beclin-1表达增加均与自噬体形成正相关[25]。PI3K属于异源二聚体，Akt是其下游效应因子，当信号传导至细胞表面后，PI3K激活，Akt膜转位磷酸化激活，细胞内磷酸化的Akt通过活化下游靶基因发挥效应[26-27]。mTOR属于细胞分裂及合成的调控中心，多种信号均可通过I型PI3K/Akt传递至mTOR启动靶点复合体1(TORC1)，达到激活阈值后阻滞细胞分裂信号传递[28-29]。王建伟等[30]研究显示，DEX可通过上调mTOR蛋白、下调LC3-II蛋白表达减轻大鼠立体肺缺血再灌注损伤引起的自噬，与本研究结果相似。本研究中模型组PI3K、mTOR mRNA和蛋白相对表达量、pAkt/Akt均低于对照组，Beclin-1 mRNA和蛋白、LC3 mRNA相对表达量、LC3-II/LC3-I高于对照组，提示PNCD大鼠海马组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路处于抑制状态，自噬相关基因和蛋白异常高表达。进一步应用不同剂量DEX干预后，PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活，自噬相关基因和蛋白表达被抑制，提示PNCD大鼠存在PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制，使老年大鼠海马神经元的形态结构改变，但DEX可逆转该信号通路的抑制作用，从而减轻海马神经元自噬，改善神经功能损伤。

4 结论

本研究结果显示，DEX可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路减轻七氟醚麻醉下肝叶切除术老年大鼠神经功能损伤，并抑制海马神经元自噬，可为临床中应用DEX预防老年人群麻醉术后神经功能损伤提供理论支持，但其是否存在其他调控通路发挥作用仍需要进一步探讨。