董晨 魏永赞 王弋 郑雪文 李伟才

摘 要： 木葡聚糖内切葡聚糖酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）是一类重要的糖苷水解酶，在促进植物细胞壁延展以及响应逆境胁迫方面发挥着重要作用。为研究荔枝XTH家族基因在不同花穗处理方式下的表达情况，该文以‘妃子笑荔枝为实验材料，对‘妃子笑花穗进行疏花和喷施烯效唑处理;基于前期转录组数据库鉴定出29个LcXTH家族成员，利用荧光定量PCR（RT-qPCR）技术对LcXTH基因家族成员在不同处理后花穗的表达进行研究，分析XTH家族基因对不同花穗处理方式的响应情况。结果表明：LcXTH家族基因成员表达在对照、疏花处理和烯效唑处理后花穗不同发育阶段表达规律不同，且不同基因存在表达量的差异。其中LcXTH 亚家族Ⅲ、LcXTH 亚家族Ⅳ（LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH22和LcXTH23）成员及LcXTH20表达量较高，推测在花穗发育中起关键作用。‘妃子笑花穗疏花处理14 d后LcXTH家族大部分成员表达上调，推测疏花对LcXTH的表达起到正调控作用;‘妃子笑花穗喷施烯效唑后LcXTH家族成员的表达下调，推测烯效唑处理对LcXTH的表达起到负调控作用。

关键词： 荔枝， 不同处理， XTH基因家族， RT-qPCR， 基因表达

中图分类号： Q943

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2021）04-0514-08

Abstract： Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase （XTH） is an important class of glycoside hydrolase that plays an important role in promoting plant cell wall elongation and responding to stress. In order to study the expression of the XTH family genes in different inflorescence treatments， 29 LcXTH family members were identified with ‘Feizixiao litchi as the experimental material， based on the pre-transcriptome database. The inflorescences of litchi were treated with flower thinning and uniconazole treatment， respectively. Expressions of LcXTH gene family members in different inflorescences were studied by real-time PCR （RT-qPCR）， and the response of LcXTH family genes to different inflorescence treatments were analyzed. The results showed that the expressions of LcXTH family members were different in the different flower developmental stages after control， flower thinning treatment and uniconazole treatment， and there are differences in the expression levels of different genes. Among them， members of LcXTH subfamily Ⅲ， LcXTH subfamily Ⅳ （LcXTH2， LcXTH3， LcXTH4， LcXTH5， LcXTH6， LcXTH7， LcXTH9， LcXTH10， LcXTH11， LcXTH12， LcXTH13， LcXTH22 and LcXTH23） and LcXTH20 had higher expression levels， presumably it plays a key role in flower development. LcXTH expression was up-regulated at the 14 d after flower thinning， and we speculated flower thinning had a positive regulation effect on LcXTH. Uniconazole treatment inhibited the expression of LcXTH and negatively regulated LcXTH.

Key words： litchi， different treatments， XTH gene family， RT-qPCR， gene expression

荔枝是原產于中国重要的热带亚热带水果，目前荔枝产业已成为中国南方热作区的支柱产业之一，在农村经济的发展及热区果农收入水平的提高方面发挥着举足轻重的作用。‘妃子笑荔枝花穗具有花穗长、花量大等特点，生产上需要对荔枝的花穗进行调控处理提高坐果，调控措施通过机械疏花或是化学调控。荔枝花穗的生长和发育涉及细胞壁松动和用于修饰细胞的细胞壁中的各种蛋白质在细胞生长和发育期间细胞壁的重塑。众所周知，纤维素-半纤维素网络在细胞壁重塑方面起主导作用，其中木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）是细胞壁重构过程的关键酶。木葡聚糖内切葡聚糖酶/水解酶（XTHs）在促进植物细胞壁延展以及响应逆境胁迫方面发挥着重要的作用。木葡聚糖内切葡聚糖酶/水解酶由多基因家族编码的一大类蛋白质，属于糖基水解酶家族16，具有转糖基酶（XET）和水解酶（XEH）双重作用（Nishitani & Tominaga，1992）。大多数XTH酶具有保守的DEIDFEFLG基序，被认为是木葡聚糖内切水解酶（XEH）活性和木葡聚糖内切葡聚糖酶（XET）活性的催化位点（Campbell & Braam，1998）。XTH基因家族的另一个结构特征是该基因的第一个外显子的最前端序列编码并将XTH蛋白转运到细胞膜或细胞壁的信号肽（Yokoyama et al.，2004）。在植物体中XTH多以基因家族的形式存在，目前随着多个物种的基因组测序完成，越来越多的植物，如拟南芥（Berardini et al.， 2004）、水稻（Yokoyama et al.，2004）、小麦（Liu et al.，2007）、草莓（Opazo et al.，2010）、谷子（元香梅等，2017）、番茄（Saladié et al.，2006）、苎麻（陈悰，2017）、毛果杨（Geislerlee et al.，2006）等的XTH基因家族得以鉴定。董晨等（2019）基于转录组对荔枝XTH基因家族29个成员进行了鉴定及生物信息学分析，通过对XTH基因家族29个成员聚类分成4个亚家族，本研究在前期研究工作基础上，通过对‘妃子笑荔枝花穗进行短截疏花和喷施烯效唑处理，利用RT-qPCR技术初步探索两种处理方式下花穗发育过程中LcXTH基因家族不同亚家族的表达变化规律，为深入了解XTH基因的功能及花穗发育过程中的调控机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究中供试材料‘妃子笑荔枝取自广东省湛江市湖秀新村南亚热带作物研究所荔枝栽培示范园。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理 ‘妃子笑试验树随机选择，选择标准为树龄相同、长势相近，选取9株为试验树，在试验树花穗抽生长度约18 cm时，进行以下3个处理：（1）对照（CK），不做任何处理;（2）疏花（FT）处理，将长花穗短截至15 cm;（3）烯效唑（Un）处理，采用浓度为50 μg·mL-1烯效唑（品牌为四川国光，有效成分含量为5%）喷施花穗，喷至花穗滴水;完全随机区组排列，单株小区，3次重复。处理后定期观察，分别取对照及两种处理后不同时间点（0、7、14、28、42 d）的整个花穗，液氮速冻后存放于-80 ℃冰箱备用，用于RNA的提取。

1.2.2 荔枝XTH基因家族表达分析 采用华越洋生物科技有限公司生产的RNA提取试剂盒提取花穗总RNA。取提取后样品1 μL检测RNA质量和浓度，样品符合要求后，利用 M-MLV 逆转录酶（TaKaRa ）将其反转录合成cDNA。扩增荔枝肌动蛋白基因（GenBank登录号HQ615689）作为LcActin内参（Zhong et al.，2011），根据转录组（GenBank accession SRP092890）中注释的LcXTH的核苷酸序列（Wei et al.，2017），利用在线软件Primer3plus设计荧光定量引物（引物序列见表 1），通过BLAST分析引物的特异性，委托广州艾基生物技术有限公司合成引物序列。RT-qPCR分析采用SYBR Premix Ex TaqTM （ TaKaRa） 试剂盒，Roche 480 Ⅱ定量PCR系统（瑞士），采用384孔板，RT-qPCR反应体系为 10 μL， 其中 cDNA 1 μL（相当于25 ng总RNA），2 μL 基因特异性引物，5 μL 2×SYBR Premix ExTaq，用去RNA酶的 ddH2O 补足 10 μL。反应条件： 94 ℃ 预变性 2 min; 94 ℃ 15 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共40个循环。每个样品进行 3 次重复。 采用2-ΔΔCT 法计算目标基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1 LcXTH基因家族亚家族I表达情况分析

LcXTH基因家族亚家族I共有3个基因成员，分别为LcXTH18、LcXTH20和LcXTH27。3个基因在不同处理花穗发育的不同时期表达情况见图1。LcXTH亚家族I基因在不同处理花穗不同发育阶段均有表达，但表达量存在差异;不同处理中LcXTH20的表达量最强，且均在28 d达到峰值;不同处理中LcXTH18和LcXTH27在28 d的表达量为对照>疏花>烯效唑，表明疏花处理和烯效唑處理抑制LcXTH18和LcXTH27的表达，其中烯效唑抑制效果明显。LcXTH27在不同处理42 d表达量烯效唑处理较对照和疏花处理差异显著。

2.2 LcXTH基因家族亚家族Ⅱ表达情况分析

LcXTH基因家族亚家族Ⅱ共有4个基因成员，分别为LcXTH17、LcXTH19、LcXTH26和LcXTH28。4个基因在不同处理花穗发育的不同时期表达情况见图2。LcXTH亚家族Ⅱ成员在不同处理下花穗不同发育阶段均有表达，但相对表达量较低。LcXTH17的表达在对照中表达趋势先下调，随后在14 d表达上调，28、42 d逐渐下调;疏花、烯效唑处理表达趋势与对照一致，但不同处理间存在表达量的差异，烯效唑处理相对表达量较对照和疏花处理略低。LcXTH19的表达趋势在对照和疏花处理中为逐渐下调，烯效唑处理LcXTH19的表达趋势为先下调，14 d表达上调后又逐渐下调。LcXTH26的表达在不同处理前期表达没有明显变化，在14 d疏花处理中表达明显升高，随后在28、42 d表达逐渐降低。而对照和烯效唑处理LcXTH26的表达下降的不明显。LcXTH28在不同处理中表达趋势为逐渐下调。

2.3 LcXTH基因家族亚家族Ⅲ表达情况分析

LcXTH基因家族亚家族Ⅲ共有3个基因，分别为LcXTH8、LcXTH25和LcXTH29。3个基因在不同处理花穗发育的不同时期表达情况见图3。LcXTH亚家族Ⅲ成员在不同处理花穗不同发育阶段均有表达，但在表达量存在差异。LcXTH8和LcXTH25在对照和疏花处理14 d表达量均达到峰值，烯效唑处理LcXTH8和LcXTH25表达高峰延迟，且表达量较对照和疏花处理要低。LcXTH29在疏花处理中的表达趋势与LcXTH8和LcXTH25一致。LcXTH29在相对表达量逐渐上调，在28 d表达量最高，随后表达急剧下调，而在烯效唑处理中LcXTH29表达同样在28 d达到最高，但在其他时期的表达变化不明显。

2.4 LcXTH基因家族亚家族Ⅳ表达情况分析

LcXTH基因家族亚家族Ⅳ共有19个基因，占基因家族总数的65%，分别为LcXTH1、LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH14、LcXTH15、LcXTH16、LcXTH21、LcXTH22、LcXTH23和LcXTH24。19个基因在不同处理花穗发育的不同时期表达情况见图4和图5。LcXTH亚家族Ⅳ成员在不同处理花穗不同发育阶段均有表达，但在表达量存在差异。其中LcXTH1、LcXTH14、LcXTH15和LcXTH21表达量较低，表达趋势一致;而LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH22和LcXTH23表达量较高，表达趋势大致一致，但在14 d上述LcXTH在不同处理中表达差异比较大，其中疏花处理表达量最高，对照次之，烯效唑处理表达量最低。在烯效唑处理中LcXTH表达量低于对照和疏花且表达高峰相对延迟，在42 d表达量达到峰值。LcXTH16的相对表达量在不同处理7～42 d间表达较0 d表达上调，而LcXTH24表达量在不同处理间均在7 d时达到峰值，推测其在7 d发挥主要作用。

3 讨论与结论

‘妃子笑素有爱花不惜子之说，究其原因是因大量营养消耗而导致坐果少甚至有花无果的问题，严重影响了荔枝的产量，限制产业发展。在荔枝生产上，常用的是机械短截疏花和化学调控技术。在花穗生长期对长的荔枝花穗进行短截，可明显地减少花量，增加雌花比例，提高花质和坐果率。本课题组前期研究发现一定浓度的烯效唑处理‘妃子笑荔枝可使花穗的发育暂缓生长，花穗短壮，盛花期延迟，花量大大减少，省去‘妃子笑疏花繁重紧张的工作，提高坐果率（李伟才等，2011）。

木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因（XTH）在促进植物细胞壁重塑以及响应逆境胁迫方面发挥着重要的作用。Lu et al.（2006）分别从荔枝抗裂和不抗裂两个品种中分离鉴定了3个XET基因LcXET1、LcXET2和LcXET3，其中LcXET在降低荔枝果实开裂中有着重要作用。本研究通过对‘妃子笑荔枝不同处理花穗发育过程中LcXTH基因家族的表达情况进行分析，4个不同亚家族中对照和疏花处理LcXTH基因家族在不同发育时期表达规律大概一致，而烯效唑处理LcXTH基因家族表达规律与对照和疏花处理则存在较大差异;Liu et al.（2007）研究报道GA诱导XTH的表达，调控细胞壁的重塑，而烯效唑作为GA合成的抑制剂，抑制了花穗的伸长，导致花穗生长速率降低，从而导致LcXTH的表达受抑制，表达量低于对照和疏花处理，刚好与前人研究结果相吻合。转录层面LcXTH基因家族的不同发育时期的表达模式的多样性，说明花穗发育不同时期LcXTH活性存在变化，而LcXTH活性与花穗的生长速率呈正相关。LcXTH基因家族成员在不同的发育时期表达特点，体现出LcXTH在荔枝花穗发育过程中细胞壁重构方面发挥重要作用。花穗发育不同时期LcXTH基因家族表达存在差异，推测LcXTH基因家族不同成员间分别在不同的花穗发育时期发挥功能。其中LcXTH 亚家族Ⅲ、LcXTH 亚家族Ⅳ（LcXTH2、LcXTH3、LcXTH4、LcXTH5、LcXTH6、LcXTH7、LcXTH9、LcXTH10、LcXTH11、LcXTH12、LcXTH13、LcXTH22和LcXTH23）成员及LcXTH20表达量较高，推测其在花穗发育中起关键作用。

参考文献：

BERARDINI TZ， MUNDODI S， REISER L， et al.， 004. Functional annotation of the Arabidopsis genome using controlled vocabularies[J]. Plant Physiol， 135（2）：745.

CAMPBELL P， BRAAM J， 1998. Co- and/or post-translational modifications are critical for TCH4 XET activity[J]. Plant J， 15（4）：553-561.

CHEN C， 2017. Cloning and expression profiling of XTH family genes in ramie[J]. Wuhan： Huazhong Agricultural University： 27-30.[陳悰， 2017. 苎麻XTH家族基因克隆及表达分析[J]. 武汉：华中农业大学： 27-30.]

DONG C，WEI YZ， WANG Y， et al.， 2019. Transcriptome-wide identification and analysis of xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase （XTH） family gene in Litchi chinensis Sonn.[J]. Mol Plant Breed， 17（12）： 3865-3873.[董晨， 魏永赞， 王弋， 等， 2019. 基于转录组的荔枝XTH家族基因的鉴定及分析[J]. 分子植物育种， 17（12）： 3865-3873]

GEISLERLEE J， GEISLER M， COUTINHO PM， et al.，2006. Poplar carbohydrate-active enzymes gene identification and expression analyses[J]. Plant Physiol， 140（3）： 946-962.

LI WC， WEI YZ， XIE JH， et al.， 2011. The invention relates to a regulation method of ‘Feizixiao litchi inflorescences[P]. Guangdong： CN102132666A， 2011-07-27.[李伟才， 魏永赞， 谢江辉， 等， 2011. 一种‘妃子笑荔枝的花穗调控方法[P]. 广东：CN102132666A， 2011-07-27.]

LIU YB， LU SM， ZHANG JF， et al.， 2007. A xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase involves in growth of primary root and alters the deposition of cellulose in Arabidopsis[J]. Planta， 226（6）：1547-1560.

LIU Y， LIU DC， ZHANG HY， et al.， 2007. The α- and β-expansin and xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase gene families of wheat： Molecular cloning， gene expression， and EST data mining[J]. Genomics， 90（4）：516.

LU W， WANG Y， JIANG Y， et al.， 2006. Differential expression of litchi XET genes in relation to fruit growth[J]. Plant Physiol Biochem， 44（44）：707-713.

NISHITANI K， TOMINAGA R， 1992. Endo-xyloglucan transferase， a novel class of glycosyltransferase that catalyzes transfer of a segment of xyloglucan molecule to another xyloglucan molecule[J]. J Biol Chem， 267（29）： 21058-21064.

OPAZO MC， FIGUEROA CR， HENRIQUEZ J， et al.， 2010. Characterization of two divergent cDNAs encoding xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase （XTH） expressed in Fragaria chiloensis fruit[J]. Plant Sci Int J Exp Plant Biol， 179（5）：479.

SALADIM， ROSE JK， COSGROVE DJ， et al.， 2006. Characterization of a new xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase （XTH） from ripening tomato fruit and implications for the diverse modes of enzymic action[J]. Plant J Cell Mol Biol， 47（2）：282-295.

WEI YZ， DONG C， ZHANG HN， et al.， 2017. Transcriptional changes in litchi （Litchi chinensis Sonn.） inflorescences treated with uniconazole[J]. PLoS ONE， 12（4）：e176053.

YOKOYAMA R， ROSE JKC， NISHITANI K， 2004. A Surprising diversity and abundance of xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases in rice[J]. Classif Exp Anal[J]. Plant Physiol， 134（3）：1088.

YUAN XM， HE L， ZHANG KY， et al.， 2017. Analysis of XTH genes that related to drought stress in foxtail millet[J]. J Shanxi Agric Univ （Nat Sci Ed）， 37（1）： 1-6.[元香梅， 禾璐， 张凯烨，等， 2017. 谷子XTH基因家族與抗旱相关基因的分析[J]. 山西农业大学学报（自然科学版）， 37（1）： 1-6].

ZHONG HY， CHEN JW， LI CQ， et al.， 2011. Selection of reliable reference genes for expression studies by reverse transcription quantitative real-time PCR in litchi under different experimental conditions[J]. Pant Cell Rep， 30（4）：641-653.

（责任编辑 李 莉）