郑威 孙文文 董学明 张秋颖 于雪飞 陈宁

摘 要： 為研究八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase）基因在龙眼类胡萝卜素合成途径中的作用机制，该文从龙眼转录组数据中筛选获得一个PSY基因，命名为DlPSY，采用生物信息学方法对龙眼PSY蛋白的一级结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、亲疏水性、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构、卷曲螺旋、蛋白质结合位点、系统进化树、蛋白质互作等进行分析和预测，并同时运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术对DlPSY基因在龙眼根和叶中的差异表达进行分析。结果表明：龙眼DlPSY基因长度为1 260 bp，编码420个氨基酸;生物信息学预测DlPSY蛋白具有Isoprenoid Biosyn C1超家族结构，含有信号肽，为分泌性蛋白，无跨膜结构，是一种可溶性亲水蛋白，定位于膜外;DlPSY蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成，具有卷曲螺旋。Ramachandran评估结果表明应用SWISS-MODEL构建的蛋白质三级结构模型可靠，其配体结合位点为344Phe和347Lys。RT-qPCR分析结果表明DlPSY基因在龙眼根和叶中均有表达，叶中表达量高于其在根中的表达量。该研究结果为下一步采用遗传学方法提高龙眼中类胡萝卜素的含量奠定理论基础。

关键词： 龙眼， DlPSY基因， 生物信息学， 基因表达

中图分类号： Q943

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2021）04-0546-13

Abstract： To study the function of phytoene synthase gene in carotenoid synthesis of Dimocarpus longan Lour. （D. longan）， a DlPSY gene identified from D. longan RNA-seq data was screened and analyzed in this research by bioinformatics methods including the primary structure of protein， physicochemical properties， signal peptide， transmembrane structure， subcellular localization， hydrophilicity， protein secondary structure and tertiary structure， coiled coil， protein binding site， phylogenetic tree， as well as protein-protein interaction. In addition， the real-time quantitative PCR （RT-qPCR） was applied in this research to analyze the expression pattern of DlPSY gene in root and leaf tissues. The bioinformatics software used in this research included NCBI BLAST， DNAMAN， NCBI CD search， Protparam， SignalP 4.1 Server， TMHMM Server， SOSUI， PSORT， ProtScale， SOPMA， COILS， SWISS-MODEL， MolProbity， 3DLigandSite， and STRING. The bioinformatics analysis results were as follows： The length of the DlPSY gene was 1 260 bp， coding for 420 amino acids; the DlPSY protein was predicted to have ‘Isoprenoid Biosyn C1 superfamily structure， contained a signal peptide， did not contain the transmembrane structure， and was a soluble hydrophilic and secretory protein which was predicted to be located outside the membrane; the DlPSY protein secondary structure was predicted to be mainly composed of α-helix and random coil; the DlPSY protein was predicted to have a coiled coil. The Ramachandran evaluation results showed that the tertiary structure model constructed by SWISS-MODEL was reliable， and its ligand binding sites were 344Phe and 347Lys， respectively. In addition， the expression pattern of the DlPSY gene was analyzed by RT-qPCR， the results of which showed that the DlPSY gene was expressed in roots and leaves of D. longan but with the different expression levels. The expression level of DlPSY gene was higher in leaves than that in roots. The results of this study will enrich our knowledge on PSY gene family and also lay a foundation for further improving the carotenoid content in D. longan by genetic methods.

Key words： Dimocarpus longan ， DlPSY gene， bioinformatics， gene expression

龙眼（Dimocarpus longan），又名桂圆、益智，味甘、淡，性平，属于无患子科常青果树，具有清热解毒之功效（黄春燕等，2019）。龙眼原产于我国南方，是主要的栽培水果之一，但在泰国、印度和越南等地也有广泛的种植（Campbell & Campbell，2001;Jiang et al.， 2002）。龙眼中含有丰富的膳食纤维、维生素、蛋白质、多糖和矿物质等（Chaikham & Prangthip，2015），对人体的健康十分有益，可以清除自由基，降低血糖，调节免疫系统、神经系统和内分泌系统等（Jiang et al.，2014; Li et al.，2015）。龙眼中还含有多种次生代谢产物，如酚酸、类黄酮和类胡萝卜素等，具有抗氧化、抗血清酶，抗突变、抗炎和抗癌等功效（Rangkadilok et al.，2007; Prasad et al.，2010）。

类胡萝卜素是高等植物中的一类重要的次生代谢产物，属烯萜类化合物，分子式为C40H56，分为胡萝卜素和叶黄素两大类。类胡萝卜素主要存在于植物的叶绿体和色素体膜上，参与光合作用并保护组织不受光氧化损伤等重要功能（Robert et al.，2004;Sanae et al.，2018）。在高等植物中，类胡萝卜素可以使组织和器官等（如花和果实）呈现出鲜艳的颜色，如黄色、橙色和红色等，使植物可以吸引传粉者（Suzuki et al.，2007;Tian et al.，2018）。除此之外，类胡萝卜素还具有多种生物活性，如抗氧化，提高人体免疫力，对心血管疾病、某些肿瘤具有一定的预防和治疗作用（王庆伟，2000）。类胡萝卜素是由八个异戊二烯单位缩合而成的类异戊二烯化合物（Li et al.，1996）。迄今为止，已经报道了约有750种天然类胡萝卜素，它们在光捕获、光保护和信号传导等方面发挥重要的作用（Gruszecki & Strzaka，2005; Nisar et al.，2015）。萜类化合物的生物合成途径有甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径和甲羟戊酸（MVA）途徑。在光照条件下，类胡萝卜素的合成途径以MEP为主（霍培等，2011）。该途径在很多植物中予以详细阐述（图1），其中类胡萝卜素合成的第一步是由八氢番茄红素合成酶（PSY）催化生成八氢番茄红素。PSY是类胡萝卜素生物合成途径中第一个关键酶，起限速作用（Zhang & Dubcovsky，2011）。大量研究表明PSY基因的表达水平影响植物中类胡萝卜素的积累（Fray et al.，1995;Shewmaker et al.，1999）。

龙眼在我国的种植面积广，资源丰富，其根、叶、花和种子等因含有类黄酮、萜类、多糖、酚酸等多种药用成分可作为药材使用，在我国已经有一百多年的应用历史（Thitiratsaku & Anprung，2014）。然而龙眼各组织中的药用成分含量较少，限制了龙眼作为中药材的应用范围及药用价值。本文对龙眼类胡萝卜素合成途径中关键的合成酶PSY蛋白进行全面的生物信息学分析，并运用RT-qPCR技术对该基因在龙眼根与叶中的表达进行研究，实验结果将丰富我们对植物PSY家族的认识，同时为今后采用遗传学手段提高龙眼类胡萝卜素的含量提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 将龙眼种子置于流水中冲洗48 h后播种于哈尔滨商业大学药学院植物培养室的塑胶花盆（40 cm × 30 cm × 10 cm）中，在恒温25 ℃、湿度50%条件下培养一个月后，选择长势一致且发育良好的龙眼植株。先用清水冲洗龙眼植株的根系除去泥土，快速用吸水纸吸取根上水分;再用RNAase-free小剪刀剪取龙眼根尖和幼叶;最后用锡纸包裹，迅速放入液氮中速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.1.2 实验仪器与试剂 主要仪器：T100TM Themal Cycler 型PCR仪（Bio-Rad，CA，USA）、CT15RE型高速低温离心机（HITACHI， Japan）、Gel DocTM XR+型凝胶成像系统（Bio-Rad， CA，USA）、Bio-Rad CFX96型实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad，CA，USA）。

主要试剂：2×TransTaq High Fidelity （HiFi） PCR SuperMix Ⅱ （Transgen，Beijing，China）、TransStart Top Green qPCR SuperMix（TransGen，Beijing，China）、HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）（Vazyme，Nanjing，China）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 运用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和DNAMAN进行序列检索比对;运用CD search（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测保守结构域;运用Protparam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析蛋白理化性质;运用Signal P4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测信号肽;运用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测跨膜区;运用SOSUI（http：//harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html）进行可溶性蛋白预测;运用PSORT（http：//psort.hgc.jp）分析亚细胞定位;运用ProtScale（http：//ca.expasy.org/tools/protscale.html）分析亲疏水性;运用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）进行二级结构预测;运用COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）进行卷曲螺旋分析;运用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）进行三级结构建模;运用MolProbity（http：//molprobity.biochem.duke.edu）进行拉氏构象图分析;运用3DLigandSite（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/～3dligandsite/）预测配体结合位点;运用STRING（https：//string-db.org/）构建候选蛋白与相关蛋白的互作网络。

1.2.2 龙眼总RNA提取与cDNA合成 从-80 ℃超低温冰箱中取出龙眼的根和叶，分别将其研磨成细粉状。取1.5 mL离心管，将研磨好的细粉放入其中，加入700 μL CTAB裂解液，充分震荡混匀，65 ℃水浴10 min，每隔2 min摇晃一次，冰浴2 min。将离心管放入低温离心机，4 ℃，12 000 r·min-1离心2 min;取上清液至新的1.5 mL离心管中，加入350 μL水饱和酚和350 μL氯仿，抽提一次，4 ℃，1 2 000 r·min-1离心2 min，重复一次;加入700 μL氯仿提取一次，12 000 r·min-1 4 ℃ 离心2 min，重复一次;取上清，加入250 μL无水乙醇和250 μL 8 mol·L-1 LiCl，冰上静置20 min，4 ℃，1 2000 r·min-1离心20 min;弃上清，75%乙醇洗涤两次，风干5 min;加入30 μL DEPC，得到总RNA。根据Vazyme 公司 HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）产品说明书进行逆转录，得到cDNA，-20 ℃保存于冰箱备用。

1.2.3 DlPSY基因差异表达分析 根据DlPSY基因序列，设计RT-qPCR的上游和下游引物。上游引物为ACTGTGTCCGATAAGGCAGC，下游引物为AACGGCTTTAGACAGGTGGG。依据 TransStart Top Green qPCR SuperMix 试剂盒说明书进行基因定量分析实验。反应体系（20 μL）：TransStart Top Green qPCR SuperMix10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物各1 μL，根和叶cDNA 模板各1 μL。RT-qPCR反应条件为预变性95 ℃，30 s;95 ℃变性30 s，60 ℃退火10 s，延伸30 s，扩增40个循环。采用 2-ΔΔCt 方法（Schmittgen & Livak，2008）计算PSY基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1 DlPSY一级结构和理化性质分析

应用ExPASy ProtParam 分析DlPSY的氨基酸组成及理化性质。结果表明，DlPSY蛋白由420个氨基酸组成（图2），其中Leu占比最大为10.2%，His占比最小为0.5%;DlPSY蛋白质的总原子数为6 717，相对分子量为47 593.70，420个氨基酸中有52个是负电荷氨基酸残基（Asp+Glu），60个是正电荷氨基酸残基（Arg+Lys），其预测的理论等电点PI为8.95，呈碱性;在波长280 nm下，假设所有半胱氨酸均来自胱氨酸，其DlPSY的消光系数为71 195 m-1·cm-1，假设无半胱氨酸残基存在，其消光系数为70 820 m-1·cm-1;DlPSY的不稳定系数为53.51，预测该蛋白为不稳定蛋白;脂肪系数为90.81;DlPSY的总平均亲水性为-0.260，预测DlPSY为亲水蛋白。

2.2 DlPSY蛋白的保守结构域分析

采用NCBI CD search分析DlPSY蛋白序列保守结构域，结果如图3所示。DlPSY基因编码八氢番茄红素合成酶，具有Isoprenoid Biosyn C1超家族结构。

2.3 DlPSY蛋白的信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位及亲疏水性分析

运用SignalP 4.1 Server对DlPSY 蛋白进行信号肽预测，结果如图4所示。DlPSY的最大剪切位点值（C-score）为0.413。最大综合剪切位点值（Y-score）为0.439，两个位点都在第21位氨基酸。最大信号肽值（S-score）在第13位氨基酸，为0.647，大于阈值0.5，预测DlPSY蛋白含有信号肽，为分泌性蛋白。

采用TMHMM Server v.2.0 对DlPSY 蛋白跨膜结构进行分析（图 5），结果表明DlPSY不含有跨膜螺旋（TMHs），无跨膜区;非跨膜螺旋区（ExpAA）概率为0.235 91，预测该蛋白为非跨膜蛋白;该蛋白质的 N 末端位于膜内侧的概率为 0.172 34，總体位于膜外，整条肽链的跨膜结构预测值小于1，推测其不存在跨膜结构域。应用 PSORT对DlPSY细胞内定位进行预测，结果如表1所示，预测DlPSY蛋白可能存在于膜外。

通过ExPASY ProtScale预测DlPSY氨基酸序列的亲疏水性（图6），预测结果的正分值越大，疏水性越强;负分值越小，其亲水性越强。分析结果表明，DlPSY最大正分值（2.678）位于肽链中的第6位氨基酸，最小负分值（-3.022）位于第57位氨基酸，整条肽链的亲水性氨基酸数量大于疏水性氨基酸数量，推测DlPSY为可溶性亲水蛋白。

2.4 DlPSY蛋白的二级结构分析

采用SOPMA对DlPSY蛋白二级结构进行预测，结果如图7所示。DlPSY蛋白中有235个氨基酸残基呈现α-螺旋结构，占肽链氨基酸总数的55.95%;49个氨基酸残基呈延伸链结构，占肽链氨基酸总数的11.67%;17个氨基酸残基呈 β-转角结构，占肽链氨基酸总数的4.05%;119个氨基酸残基呈无规则卷曲结构，占肽链氨基酸总数的28.33%。DlPSY蛋白的主要结构为α-螺旋和无规则卷曲，该结构有助于蛋白质的稳定性。

2.5 DlPSY蛋白的卷曲螺旋域分析

应用ExPASy COILS对DlPSY蛋白进行卷曲螺旋域预测（图8），加权与未加权的预测结果一致，推测 DlPSY蛋白含卷曲螺旋域。

2.6 DlPSY蛋白三级结构建模及结合位点预测

利用SWISS-MODEL对DlPSY进行蛋白质三级结构建模（PyMOL视图） （图 9），并利用MolProbity Ramachandran评估DlPSY的三级结构模型（图10）。结果显示，DlPSY蛋白95%氨基酸位点位于最佳区域内，100%氨基酸位点位于允许区域范围，表明DlPSY蛋白质三级结构模型准确可靠。利用3DLigand-Site预测DlPSY蛋白质配体结合位点为344Phe和347Lys（图11）。

2.7 PSY序列比对及系统进化树的构建

应用Bioedit对黄水仙（X78814）、胡椒（X68017）、番茄（KC767847.1）、拟南芥（L25812）、水稻（AY452768）、柑橘（AF152892）、柿子（FJ594485.1）、柚子（KP462726.1）、向日葵（CAC27383.1）、草莓（ACR61392.1）、甜瓜（AEH03199.1）、枸杞（AAW88383.1）、广藿香（AHJ90431.1）、芒果（JQ277716.1）、温州蜜柑（AF220218.1）、苦瓜（AAR86104.1）和南瓜（AEK86564.1）的PSY蛋白进行序列比对（图12），采用MEGA10进行系统进化树的构建（图13），探索PSY蛋白在不同物种之间的进化关系。结果表明，DlPSY与柑橘、温州蜜柑、柚子、芒果的PSY同源性较高，推测它们来自同一个祖先，与甜瓜PSY的同源性较低，亲缘关系较远。

2.8 DlPSY蛋白互作关系

应用 STRING 交互式数据库构建候选蛋白与相关蛋白的相互作用网络，分析预测与DlPSY相互作用的蛋白。选择拟南芥为模式植物，构建出的蛋白互作结果如图14所示。DlPSY与ZDS（ζ-胡萝卜素脱氢酶）、LUT2（番茄红素ε环化酶）、Z-ISO（ζ-胡萝卜素异构酶）、LYC（番茄红素β环化酶）、ABA1（玉米黄质环氧酶）、CRTISO（番茄红素异构酶）、PDS3（15-顺式八氢番茄红素去饱和酶）、GGPS1（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶大亚基1）、DXR（1-脱氧-D-木糖5-磷酸还原异构酶）和CLA1（1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶）具有相互作用。

2.9 DlPSY基因在龙眼根和叶中的差异表达分析

采用实时荧光定量PCR 技术（RT-qPCR）分析从龙眼转录组数据中筛选获得的DlPSY基因在根和叶中的相对表达量，结果如图15所示。DlPSY基因在龙眼根和叶中均有表达，叶中的表达量高于其在根中的表达量。

3 讨论与结论

类胡萝卜素是植物中的一类重要的次生代谢产物，属于亲脂性类异戊二烯化合物（Walter & Strack，2011），其合成途径在很多植物中给予了详细的介绍。PSY基因是类胡萝卜素合成途径中的首个合成酶基因，起到限速的作用，影响类胡萝卜素在植物组织中的积累（Zhang & Dubcovsky，2011）。在本研究中，我们根据龙眼转录组数据筛选获得一个DlPSY基因，编码420个氨基酸。生物信息学分析表明，该蛋白为碱性不稳定蛋白，不存在跨膜区，具有可溶和亲水的特性，存在于膜外，二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲，本研究结果与桃、枇杷、芒果等PSY蛋白一致（黄建峰等，2017;梁敏华等，2018;洪敏等，2018），推测不同植物种属间PSY蛋白的亲疏水性、蛋白质二级结构等具有一定的保守性。甘薯、芥蓝等PSY蛋白主要位于叶绿体中，直接在细胞器中发挥作用;而龙眼和芒果中的PSY主要位于膜外，推测其在细胞质中合成前体蛋白后，并未进入其他亚细胞器中，而是经过加工成为成熟的蛋白质后发挥作用（薛生玲等，2017;程洁等，2017）。蛋白质折叠时能够形成亲水表面和疏水内核，并且在跨膜结构中存在高疏水区域（李卿等，2015）。本文对PSY蛋白亲疏水性分析结果表明其不存在高疏水区域， 由此推断龙眼PSY蛋白为非跨膜亲水蛋白。

RT-qPCR结果表明DlPSY基因在根和叶中均有表达，其叶中的表达量高于根。在已研究植物中，PSY基因在不同植物中的各组织表达量存在差异，沟叶结缕草ZmPSY基因在叶中的表达量较高，草莓FaPSY基因在花中的表达量较高，而西瓜ClPSY基因在果实中的表达量较高（朱海生等，2011;吕品等，2014;董笛等，2017）。相关研究表明PSY基因的表达量与类胡萝卜素在组织中的积累呈正相关，在油菜、马铃薯和番茄中转入与类胡萝卜素合成相关的PSY基因后其类胡萝卜素含量也随之提高（王玉萍等，2006;罗秀芹等，2018），因此我们推测，龙眼叶片与根相比，叶片中的类胡萝卜素的含量较高。

综上所述，本文从龙眼转录组数据库中筛选获得一个PSY基因，采用生物信息学的方法对其理化性质、亚細胞定位、亲疏水性和高级结构等进行研究，同时采用RT-qPCR技术分析DlPSY基因在龙眼根与叶中的差异表达，实验结果为后期即将开展的通过转基因方法提高类胡萝卜素的含量提供了科学依据。

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（责任编辑 李 莉）