陈琴，邱家红，王晓英，金钱荣*

（1.云南森林自然中心，云南 昆明 650224；2.三岔河镇林业和草原服务中心，云南 大姚，675413；3.金碧镇林业和草原服务中心，云南 大姚 675400）

蘑菇属（Agaricus L.）也称伞菌属,隶属于真菌界（Fungi）、担子菌门（Basidiomycota），担子菌纲（Basidiomycetes），伞菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）。蘑菇属是一类广泛分布于世界各地，营腐生生活的重要经济真菌。生长在森林、草原、田间、地头、路边、庭院等地。根据国内外文献统计，近年来人们采集到和鉴定过的已知的蘑菇属的种有200～250 种[1]，但是,随着研究的不断深入,更多新的物种也将不断被发现。多数蘑菇属真菌具有食用、药用或保健价值,开发价值较高，是理想的天然食品。本研究则是对泰国清迈蘑菇属真菌进行分子系统学初步研究，这将对该属真菌的驯化、育种，增加食用菌的品种，蘑菇产品的开发具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试材料

本研究以泰国清迈蘑菇属标本为主，供试标本为干燥标本，共计8份。标本详情见表1。

表1 蘑菇属真菌标本来源表

1.1.2 方法来源

DNA提取试剂盒、PCR扩增所用混合液、rDNA ITS分析物、BM2000 DNA Marker，DM0101(Biomed)。

1.2 实验用品

用具及仪器：A4绘图纸、铅笔、橡皮、小刀、培养皿、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、电子显微镜、高压灭菌锅(YXQ-LS-50-SII)、无菌操作台(AIR TECH)、酒精灯、打火机、移液枪(含枪头)、PCR 扩增仪(My-CyclerTMthermal cycler，BIO-RAD)、琼脂糖凝胶电泳仪(DYY-Ⅲ-6B)、紫外成像仪、台式离心机(eppendorf，Centrifuge 5 417R)、小型离心机、台式恒温振荡 器(AUTO SCIENCE，SWB-2 000 Horizontal Shaking Bath)、制冰机(SIM-F140，SANYO)。

试剂：75 %酒精、95 %酒精、5 %KOH、无水乙醇、TAE、去离子水、蒸馏水、琼脂糖凝胶等试剂。

1.3 工作程序

1.3.1 DNA的提取

PCR 扩增→PCR 反应体系→PCR 反应程序→PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测→ITS 序列测定。

1.3.2 ITS序列的系统发育分析

1.3.2.1 序列的订正

首先在BioEdit 软件中通过Graph对每条ITS序列的测定结果进行复检：分别将每个标本菌株的ITS4和ITS5测定的序列进行复检，经过人工校正排除程序误读，最后将ITS4 和ITS5 序列拼接为一条ITS序列。

此外，通过美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，简称NCBI）的网站对所有序列进行Blast，检查是否所有序列都属于蘑菇属真菌，以防测得的序列为非目的属序列。

1.3.2.2 系统发育树的构建

从GenBank 上下载参考菌株的DNA 序列作为标准序列以及本研究得到的标本序列构成数据库，在BioEdit 软件中通过ClustalX 程序进行初步校对(Alignment)和序列长度处理。利用网络数据库T-COFFEE 进行数据的比对，之后再人工进行调整校对。用ClustalX进行相关格式转换。系统发育分析中，运用PAUP4.0（Phylogenetic Analysis Using Parsimony4.0）中的最大似然法（ML）构建系统发育树，同时进行1 000次bootstrap自举法进行检测，得到系统发育树。

2 结果与分析

2.1 DNA的提取结果

本研究成功提取到25份标本的DNA。

2.2 PCR扩增

提出DNA的25份标本中有18份能够完成PCR扩增，电泳条带较为明亮，另外7 份样品（zrl-131、zrl-132、zrl-134、zrl-144、zrl-185、zrl-245、zrl-247）经重复后电泳效果仍不理想，无法测序。

2.3 序列测定

本实验送检测序样品共计18 个,通过设计的引物，有8个样品（zrl-188、zrl-193、zrl-219、zrl-221、zrl-229、zrl-235、zrl-273、zrl-276）ITS为“-”，无正常的序列，有2 个样品(zrl-189、zrl-218)测序出现大面积套峰，无法完全读出。因此测序正常的序列共8 个，其中有一个样品无序列号（zrl-4049），则正常的序列共7 个，ITS 全区段（ITS1-5.8 s rDNA-ITS2）序列长度在651～664 bp，其中5.8 s 序列是保守序列，基本没有变化；ITS1 和ITS2 为内含子序列，变化较大。首先，经过NCBI 中的BLAST 程序对所有序列进行比对，发现全部7 个样品全部属于蘑菇属真菌。最终将本实验测得的7 条序列与GenBank 下载的124 条蘑菇属真菌及4条外类群真菌的ITS 序列构成系统发育数据（详见表2）。

表2 构成数据库的序列情况

续 表

续 表

2.5 系统发育树

利用网站http://www.phylogeny.fr/对全部135 条序列进行分析，分子系统发育树，结果如图1。

由图1 可以看出，标本zrl-258 属于Xanthodermatei 组；标 本zrl-160 属 于Sanguinolent 组；标本zrl-133 属于TRⅠ组；标本zrl-265 属于Arvense 组；有3 个标本属于Minores，分别是zrl-147、zrl-287、zrl-149，其中标本zrl-147与zrl-287属于同一个种，碱基位点完全相同。

图1 系统发育树

3 讨论

一是与ITS结合能够较科学的解决蘑菇属真菌分类鉴定的问题，避免单靠蘑菇属真菌形态分类引起的分歧问题。

二是从分子实验结果与系统进化树的结果看，本次研究的25份标本，有7份标本具备了分子研究结果并参与到系统进化树的构成对比结果当中，分别属于Xanthodermatei、Sanguinolent、TRⅠ、Arvense和Minores五个组，其中Arvense组的蘑菇均可食用，经济价值较高，由此可后期进行该方面的引种及开发研究。

三是研究对分子数据解决Minores 组真菌的系统发育问题进行了初探，为进一步深入测定其他区段的序列以解决Minores 组真菌的系统发育问题打下了基础。