万宇平 ，吴小胜 ，贾芳芳 ，崔娜 ，马玉华 ，何方洋

1.北京勤邦生物技术有限公司（北京 102206）；2.北京望尔生物技术有限公司（北京 102206）；3.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心（北京 102206）

多菌灵（carbendazim），化学名称为N-（2-苯并吡唑基）氨基甲酸甲酯，属于苯并吡唑类，是一种病害防治杀菌剂，被广泛应用于农作物。然而施用多菌灵的目标物会长期残留该药物，人、畜食用后，会引起头晕、恶心、呕吐、抽搐等一系列中毒症状[1-3]。

因此，目前很多国家都规定了多菌灵在农副产品中的最高残留限量。GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定了果蔬、茶叶中多菌灵的MRL范围：20～5 000 μg/kg。我国很多标准采用的均为仪器方法。目前，国内对于多菌灵的分析方法主要有分光光度法、超高效液相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、液相色谱法、拉曼光谱法等[6-12]，以上方法多为仪器方法，缺点是成本高、步骤复杂，不便于基层实验室进行检测[13-20]。为了方便、快速、低成本地检测烟叶中多菌灵残留[21]，此次试验研发了一种多菌灵胶体金快速检测试纸条，适合基层检测部门大批量筛查样本。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

多菌灵、噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑标准品（纯度≥95%，北京标准物质研究中心）；牛血清白蛋白、卵清蛋白（分析纯，美国Sigma公司）；三氟乙酸、三氟乙酸酐、硝酸铵、氢氧化钠、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯化锡、碳二亚胺、石油醚、硫化铵、二甲基甲酰胺、碳酸钾（分析纯，北京百欣试剂公司）；果蔬、茶叶、烟叶（市售）；多菌灵抗体（本研究平台）。

GT-700胶体金分析仪（北京勤邦生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多菌灵半抗原的制备

20 mL三氟乙酸加2 mL三氟乙酸酐，冰水浴，降至0 ℃，加0.5 g硝酸铵，搅拌1 h，加入含1.0 g多菌灵的三氟乙酸溶液，继续搅拌，反应2 h。停止反应，就稀氢氧化钠溶液中和到中性，二氯甲烷萃取，水洗，蒸干，乙醚洗涤结晶，得到化合物a（0.76 g，收率67%）。1H NMR（CDCl3，300 MHz）δ：8.31（1H，dd，J=1.616，J=1.239），7.69（1H，dd，J=8.716，J=1.616），7.64（1H，dd，J=8.716，J=1.239），3.85（3H，s）。

0.7 g化合物a加乙醇溶解，加10 mL含0.43 g氯化锡水溶液，通入氮气，加入回流反应3 h；然后旋蒸、萃取、浓缩，利用体积比1∶1的石油醚-乙酸乙酯对其进行洗脱分离，得到b产物（半抗原化合物，0.54 g，收率83%）。1H NMR（CDCl3，300 MHz）δ：3.79（3H，s），6.27（2H，s），6.90（1H，dd，J=2.225，J=1.850），6.46（1H，dd，J=8.422，J=2.225），7.34（1H，dd，J=8.422，J=1.850），5.00（1H，s），9.15（1H，s）。

图1 多菌灵半抗原合成

取上述产物，经核磁共振氢谱测定，化学位移δ=6.27的为苯环上芳香胺的共振吸收峰，该吸收峰的存在证明半抗原合成成功。

1.2.2 免疫原的制备

称取50 mg牛血清白蛋白，使之充分溶解在3.8 mL 0.1 mol/L PBS（pH 7.2）中，得到溶液A；用0.2 mL H2O溶解30 mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，加入至溶液A中，搅拌30 min；取15 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中，然后缓慢加入到蛋白中溶解，搅拌24 h。透析后分装，于-20 ℃保存。

1.2.3 包被原的制备

称取50 mg卵清蛋白，使之充分溶解在3.8 mL 0.1 mol/L PBS（pH 7.2）中，得到溶液B；用0.2 mL H2O溶解30 mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，加入至溶液B中，搅拌30 min；取13 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中，然后缓慢加入到蛋白中溶解，搅拌24 h。透析后分装，于-20℃保存。

1.2.4 多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物的制备

调节胶体金溶液的pH至7.0，每毫升胶体金溶液加入30 μg多菌灵单克隆抗体，搅拌后加入10% BSA，静置、离心，将沉淀重悬，置4 ℃备用。

1.2.5 样本前处理方法

1) 干烟叶：称取1.0 g粉碎的样本至50 mL离心管中；鲜烟叶：称取2.0 g粉碎的样本至50 mL离心管中。

2) 加入10 mL 50%甲醇，充分混匀。

3) 使用滤膜进行过滤，稀释后使用。

1.2.6 检测方法

每个加样孔中加入100 μL待检液，反应10 min，判读结果。阴性（-）：T线显色比C线显色深或显色一致，均表示样本中无多菌灵药物或多菌灵药物浓度低于检测限。阳性（+）：T线显色比C线显色浅或T线不显色，表示样本中多菌灵药物浓度等于或高于检测限。无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

图2 多菌灵胶体金试纸条结果判定示意图

1.2.7 试纸条的最低检出限

样本中添加多菌灵，空白干烟叶样本的质量分数分别达到0，1 000，2 000，3 000和4 000 μg/kg，空白鲜烟叶样本的质量分数分别达到0，200，250，300和350 μg/kg，按照1.2.6所述方法，用3批不同时间制备的试纸条进行检测，每个质量分数重复5次，以此确定试纸条的最低检出限（Limit of detection，LOD）。

1.2.8 试纸条的特异性

杀菌剂种类较多，经常会合用，试验选取了4种应用广泛的杀菌剂，并分别配制质量分数均为1 000 μg/kg的噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑等药物，判断试纸条的特异性。

1.2.9 试纸条的准确性

总局办公厅关于印发食品快速检测方法评价技术规范的通知（食药监办科[2017]43号）：以假阳性率和假阴性率评价胶体金免疫层析法的准确性。取50份已确证的空白干烟叶、鲜烟叶样品，用该试纸条检测多菌灵药物残留，计算假阳性率；取50份已确证的多菌灵质量分数为2 000 μg/kg的阳性干烟叶样品以及300 μg/kg的鲜烟叶样品，用该试纸条检测多菌灵药物残留，计算假阴性率。《农残办技术材料要求及审查程序》要求试纸条假阳性率应小于5%，假阴性率应为零。

1.2.10 试纸条的稳定性

根据上述方法研制出的试纸条存放于2～8 ℃，每月固定日期测定空白干烟叶样品、添加多菌灵质量分数为2 000 μg/kg的阳性干烟叶样品各10份，以及空白鲜烟叶样品、添加多菌灵质量分数为300 μg/kg的阳性鲜烟叶样品各10份，重复测定2次。

2 结果与分析

2.1 胶体金的鉴定

制备好的胶体金溶液呈酒红色，均匀、透明、无杂质；将其置于透射电镜下观察。由图3可知，所测定的胶体金粒径在20 nm左右。

图3 胶体金电镜扫描结果（×100 000）

2.2 最低检出限

用试纸条检测干烟叶样品（多菌灵质量分数分别为0，1 000，2 000，3 000和4 000 μg/kg）和鲜烟叶样品（多菌灵质量分数分别为0，200，250，300和350 μg/kg），按照上述方法进行检测，确定检测限。以只出现质控线时的最低标准品质量分数作为试纸条的检测限，依此为衡量标准，该试纸条对干烟叶的检测限为2 000 μg/kg，对鲜烟叶的检测限为300 μg/kg，结果见表1。

表1 多菌灵快速检测试纸条对样品的最低检出限

2.3 特异性

通过该试纸条检测1 000 μg/kg的噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑等药物，结果见图4。结果显示，检测结果均呈阴性，即与其他药物无交叉反应，该试纸条特异性较好。

图4 特异性试验结果

2.4 准确性

准确性通过测定试纸条的假阳性率和假阴性率来评价。由图5（A）（由于图片过多，图5仅为部分结果）可知，试纸条的假阳性率低于5%；由图5（B）可知，试纸条的假阴性率为0，符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求。

图5 假阳性（A）及假阴性（B）试验结果

2.5 稳定性

干烟叶检测结果见图6（由于图片过多，图6仅为部分结果）。12个月内，试纸条的假阳性率和假阴性率均符合要求，即试纸条在2～8 ℃下能够保存12个月。

图6 稳定性试验结果

3 讨论与结论

1) 通过检索文献，发现多菌灵残留量的快速检测方法主要集中在仪器方法，快速检测方法非常少，尚未检索到能够同时检测干烟叶、鲜烟叶中多菌灵的胶体金试纸等快速检测方法的报道。此次研究的多菌灵胶体金试纸条操作简便，无需设备，具有实用性，对比仪器方法来说，更加友好[21]。然而，GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定了多菌灵对6种谷物、4种油料油脂、16种蔬菜、28种水果等几十种食品类别的最大残留限量，由于本平台偏重实际应用，因此此次研究样本较少，今后可根据市场需求，结合该国家标准进行样本拓展。

2) 多菌灵原料药经硝化反应，在苯环上引入硝基，经还原后得到带有芳香胺的半抗原产物。由此制备的半抗原进而制备成免疫原和包被原，制备方法均不繁琐，便于进行商业化生产。