张豪洋 党炳俊 金伊楠 李子玮 孙燕鑫 郭笑恒 许自成

(河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002)

我国是烟草种植大国，植烟面积超过100万hm2，年均产生的烟草废弃物多达400万t[1]。烟草废弃物中含有大量有害物质，如烟碱、氨基联苯等，随意排放会对生态环境和人类健康造成严重危害。美国环境保护署(EPA)早在1994年就在环境限制释放目录清单中加入烟碱，欧盟也有相关法律规定，当烟草废弃物中烟碱质量分数高于0.05%时，即被归类为有害危险废弃物，需谨慎处理。然而，烟草废弃物中含有茄尼醇等重要化合物[2]155，其独特的物质组成及物理特性使其具有较高的应用价值。

由于人们对烟草的清洁生产和烟草废弃物的资源化利用意识相对较弱，导致大量的烟草废弃物不能得到及时有效处理。烟草废弃物的资源化、经济化利用已成为烟草行业发展亟待解决的问题。目前，烟草废弃物的资源化途径主要有3种：(1)提取烟草废弃物中的重要化合物；(2)将烟草废弃物制成功能型材料[3]；(3)将烟草废弃物堆肥制成有机肥。烟草废弃物资源化利用前，先要妥善处理其中的烟碱。烟碱又名尼古丁，是由吡啶环与吡咯环组成的结构稳定的有毒杂环化合物，广泛存在于多种茄科(Solanaceae)植物中，是烟草中含量最多的一种生物碱[4]，其对环境可造成一定危害。微生物降解烟碱具有降解能力强、功能微生物种类丰富、降解途径多样、对环境影响小等特性，是一种低成本、高效率的烟碱处理方法。因此，通过微生物材料以及生物调控技术对烟草废弃物进行处理，在提高烟草资源利用率、增强土壤肥力和保护生态环境等方面具有重要意义。因此，本研究对烟草废弃物中烟碱生物调控技术进行了综述，以期为处理烟草废弃物、降低烟碱含量以及缓解环境污染等研究提供参考。

1 烟碱的危害及污染来源

1.1 烟碱的危害

烟碱是一种有毒的杂环化合物，纯烟碱在室温下为无色或淡黄色的油状液体，在低于60 ℃时可与水以任意比例混合，也可溶于醇类、醚类和氯仿等有机溶剂[5]。烟碱在自然条件下不易被降解，且易溶于水，容易通过淋溶作用进入土壤和地下水，造成土壤和水污染，破坏生态平衡。烟碱进入人体后会与中枢神经系统的烟碱型乙酰胆碱受体相结合，进而对人体的多种组织和细胞造成损害[6]。烟碱还会增加血浆的浓度，导致心血管等诸多部位疾病发病率的升高[7]。

1.2 烟碱的污染来源

造成环境污染的烟碱主要来源于烟草废弃物，烟草中烟碱含量可占烟草生物碱总量的95%[8]，烟草废弃物中的烟碱质量分数高达0.5%～8.0%。除此之外，烟碱污染的另一大源头是新烟碱型农药。近年来，新烟碱类杀虫剂吡虫啉、噻虫嗪和啶虫脒凭借其高效、广谱等特点，已成为我国农业生产中使用的第四大类农药，广泛应用于果蔬的病虫害防治中[9]。随着新烟碱型农药的广泛使用，其对人类健康的影响和对生态环境的污染已成为科技工作者们必须面对和研究的问题，经过多年的研究发现，两种来源的烟碱都可通过具有烟碱降解能力的微生物进行控制和解决。

2 烟碱生物调控技术

2.1 可降解烟碱的微生物种类

现阶段的烟碱调控技术大多通过农艺措施和生长调节剂来调控烟草体内烟碱的合成，如打顶、抹杈、减少氮肥施用量和叶片喷施药剂等[10]。除此之外，常规的物理化学方法也可以降解烟碱，但这些方法不仅耗费时间且价格高昂。目前，针对烟碱的生物调控领域研究主要集中在微生物降解上，微生物作为自然界中广泛存在的微小生物体，是物质循环必不可少的推动者，其在调控烟草废弃物中的烟碱含量上发挥着积极的作用且具有重要应用前景。迄今为止，已经报道的可降解烟碱的微生物主要为细菌，真菌相对较少。可降解烟碱的细菌中50%以上属于节杆菌属(Arthrobacter)[11]和假单胞菌属(Pseudomonas)[12]，其他菌株大多为产碱菌(Alcaligenes)、无色杆菌属(Achromobacter)[13-14]、芽孢杆菌属(Bacillus)[15]和中间苍白杆菌属(Ochrobactrumintermediate)等[16]。烟碱降解菌大多为好氧微生物，主要通过矿化方式对烟碱进行降解，且这些菌株具有较强的耐烟碱性，可将烟碱转化为羧酸和氨基酸，从而起到降解有毒有害废弃物的作用。目前国内外大批研究人员从烟叶、土壤和卷烟厂废弃物中分离得到的多种烟碱降解菌及其最佳降解条件汇总于表1。

表1 具有烟碱降解能力的菌株

2.2 微生物降解烟碱的代谢途径

微生物降解烟碱的途径主要有吡啶途径、吡咯烷途径、脱甲基以及吡啶和吡咯烷交叉途径等[42-44]。

2.2.1 吡啶途径

节杆菌属微生物主要通过吡啶途径降解烟碱。在吡啶途径中，菌株先将烟碱吡啶环羟基化形成6-羟基烟碱，然后再将吡咯环氧化形成6-羟基-N-甲基麦斯明，并自发水解生成6-羟基假氧化烟碱[45]。随后通过羟基化反应生成2，6-二羟基假氧化烟碱，继而重复自发水解过程生成γ-N-甲基氨基丁酸和3,6-二羟基吡啶，其中γ-N-甲基氨基丁酸可生成γ-氨基丁酸，3,6-二羟基吡啶继续反应生成2,3,6-三羟基吡啶和马来酸[46]。烟碱吡啶途径的代谢通路见图1。

图1 吡啶途径Fig.1 Pyridine pathway

2.2.2 吡咯烷途径

吡咯烷途径始于吡咯烷环中碳氮键的氧化，是假单胞菌属的主要代谢途径。在该途径中烟碱首先脱氢生成6-羟基-N-甲基麦斯明，自发水解生成假氧化烟碱，实现吡咯环的打开，而后吡咯环脱甲胺生成3-琥珀酰吡啶，随后通过羟基化反应生成6-羟基-3-琥珀酰吡啶，最后生成2，5-二羟基吡啶和琥珀酸盐，逐步完成烟碱的分解[21]1495。烟碱吡啶烷途径的代谢通路见图2。

图2 吡咯烷途径Fig.2 Pyrrole pathway

2.2.3 脱甲基途径

脱甲基途径的第1步是吡咯环进行脱甲基化反应，其代谢产物也是2，5-二羟基吡啶和琥珀酸。但与该途径各步反应中的酶类和相关的基因描述很少，具体代谢通路还有待进一步研究[21]1496。

2.2.4 吡啶和吡咯烷交叉途径

WANG等[29]研究证实在AgrobacteriumS33中存在吡啶和吡咯烷交叉途径。并从该途径中检测出5种中间产物，其中6-羟基烟碱、6-羟基-N-甲基麦斯明和6-羟基假氧化烟碱与吡啶途径的中间产物一致，6-羟基-3-琥珀酰吡啶和2,5-二羟基吡啶与吡咯烷途径的中间产物相同。

2.2.5 其他途径

近年来，随着科研工作者对微生物降解烟碱代谢途径和降解机理的研究不断深入，新的烟碱代谢产物陆续被发现。孙柯丹[31]在研究菌株Pseudomonassp. ZUTSKD对烟碱的降解产物时发现了2,3-二吡啶、3-(2,3,4-三氢-5-吡咯基)-吡啶和可替宁等物质，推测菌株Pseudomonassp. ZUTSKD降解烟碱的第1步可能是通过可替宁脱甲基反应后生成3-(2,3,4-三氢-5-吡咯基)-吡啶。因此，菌株Pseudomonassp. ZUTSKD对烟碱可能有新的降解途径。另有学者通过分析菌株Pseudomonassp.HF-1降解烟碱的中间产物时发现了麦思明等物质[23]。RAMAN等[38]通过高效液相色谱(HPLC)和气质联用色谱(GC/MS)等对菌株PseudomonasplecoglossicidaTND35降解烟碱的过程进行研究，并检测出3种新的未知中间产物。烟碱降解菌中仍存在许多未知的代谢途径有待进一步探索，后期可从已知酶入手进行机制研究，也可对一些涉及的酶进行鉴定，或通过生物工程的手段对已知途径进行改造以生产出更加有用的合成中间体。

2.3 烟碱生物调控的研究动态

早在20世纪中叶国外就已经开展了烟碱降解的相关研究。1954年WADA等[2]156从土壤中分离出细菌A和细菌B，它们可利用烟碱作为氮和碳的唯一来源进行生长代谢，并观察到在细菌A和细菌B存在时烟草生物碱和相关化合物可被吸收。HONG等[33]从烟草种植土壤中分离出细菌菌株ND12，该菌株可利用烟碱作为唯一的碳和氮源，在28 ℃、pH=6.0的条件下14 h内完全降解1.0 g/L烟碱，ND12菌株生长的最佳烟碱质量浓度为2.5 g/L。WANG等[41]研究发现，SphingomonasmelonisTY菌株可利用烟碱作为唯一的碳、氮源生长，且该菌株通过NdpT这类烟碱转运相关蛋白来完成烟碱的降解。SHANG等[47]研究菌株Phanerochaetechrysosporium、Bacillusthuringiensis时发现它们可通过调节土壤氮含量进而降低烟叶中的烟碱含量并改善烟草质量。WANG等[48]将具有高效烟碱降解能力的Pseudomonassp. HF-1添加到被烟草废弃物污染的土壤中，与对照组相比，添加HF-1菌株的土壤表现出更强的污染处理能力、更高的pH和稳定的水分含量，且HF-1菌株可在土壤中持续存在，从而大大提高了烟草废弃物的处理效率。ZHU等[49]对Sphingomonassp. NIC1菌株的完整基因组序列进行分析，证实其可有效降解烟碱。GONG等[50]研究发现Rhodococcussp. Y22扩增可得到烟碱脱氢酶ndh的编码基因，并且在烟碱诱导下，该菌株的转录水平明显上调，具有较强的烟碱降解能力，可从烟草废弃物中降解烟碱以达到环境要求。MIHASAN等[51]利用微生物蛋白质组学对PaenarthrobacternicotinovoranspAO1中的烟碱代谢途径进行研究，发现其降解途径是由包含约40个与烟碱相关的基因组成的分解代谢质粒pAO1编码操控，该细菌能够利用烟碱作为碳源，在较低烟碱含量下进行脱氨和脱甲基之间的切换，从而实现对烟碱的降解。LI等[52]从海洋沉积物中分离出具有烟碱降解能力的细菌JQ581，根据形态、生理生化特征和16S rDNA基因分析将其鉴定为假单胞菌属成员，且烟碱降解中间体为假氧化烟碱和3-琥珀酰吡啶，并通过基因组序列分析发现该菌株含有烟碱降解的基因簇。LI等[53]从富含烟碱的环境中分离出可降解和耐受高含量烟碱的Pseudomonassp. JY-Q菌株，发现nicA2和nox基因都参与了烟碱的降解，此外hpo1和hpo2基因在降解过程中也发挥着重要作用。MARIUS等[54]通过蛋白组学方法对细菌Paenarthrobacternicotinovorans中的质粒pAO1进行分析，使用纳米液相色谱/质谱联用系统(nanoLC-MS/MS)鉴定出聚在511个非冗余蛋白簇中的801个蛋白质，蛋白质丰度的差异表明，当柠檬酸盐存在时，脱氨效果较好。

国内关于烟草废弃物中烟碱生物调控的研究起步较晚。袁勇军等[55]发现了一种能降解烟碱的细菌并命名为DN2，经过鉴定该菌属于中间苍白杆菌属，其对烟碱的最佳降解条件为30 ℃、pH 6.5。韩娜娜[56]从烟草废弃物污染的土壤中筛选出一株烟碱降解细菌并将其命名为中间苍白杆菌E3，其在pH 7.0、35 ℃、酵母膏添加量1.0 g/L的条件下对烟草加工废水中的烟碱降解率可达100%。龙章德等[57]从植烟土壤中筛选出一株可耐受8 g/L烟碱的菌株，并将其命名为Microbacteriumsp. GYC29，其烟碱降解率可达82%。李天丽等[58]从醇化烟叶中分离得到具有降解烟碱活性的菌群(Q6)，并在该菌群的烟碱代谢产物中检测到烟碱烯、2,3’-联吡啶和可替宁的存在，这些物质与烟叶品质关联密切，因此可以通过微生物降解醇化烟叶中的烟碱从而达到改善烟叶品质的目的。洪骏[59]利用具有烟碱降解能力的菌株Shinellasp. HZN7对被烟草废弃物污染的土壤进行修护，发现菌液添加量为100 g/kg时对土壤的修复效果最好，可有效去除土壤中的烟碱残留，对保护土壤生态环境起到了积极作用。刘彩红[60]从一个新的角度对烟草废弃物进行处理，通过淀粉酶酶解作用将烟草废弃物中的有害物质降解为可再利用的葡萄糖等小分子化合物，再经过加工合成酶解浓缩液，酶解浓缩液可与L-丙氨酸发生美拉德反应，进一步提升卷烟香气，实现烟草废弃物的资源化利用。汪美贞[61]通过质粒消除转化和关键基因hsp的聚合酶链反应(PCR)及反转录聚合酶链扩增(RT-PCR)等方法证明了质粒pMH1是不同于pAO1的新型烟碱降解质粒，该质粒可能含有和烟碱降解相关的hsp和amo基因。目前已有研究证实生物调控技术对烟草废弃物中的烟碱降解具有积极作用，且已发现降解率较高的菌属以及新的研究方向。

目前我国烟草废弃物资源化利用效率不高，主要原因是其中的烟碱无法得到快速有效处理。微生物种类和降解机制的多样性为卷烟的制造加工和烟草废弃物污染的处理提供了更加丰富的资源和更加多样化的选择，但因微生物降解烟碱的机制较为复杂，对降解方式和降解机制的研究还不够细化，因此目前这项技术还没有高效地应用于实践中，后续可以加深烟碱生物调控从基础研究向应用研究的转化。

2.4 生物调控技术的其他应用

在烟草生产过程中污水处理厂面临大量含烟碱的废水无法解决的问题，通过具有烟碱降解能力的微生物或生物催化剂进行调控，可以有效降低烟碱对人体和生态环境所造成的危害，对缓解烟草废弃物造成的环境污染起到积极作用。我国多数卷烟厂储存上部烟叶，但上部烟叶的烟碱含量偏高，通常不易在卷烟配方中使用，而利用微生物降解烟碱可改善烟叶的内在品质，提高烟叶资源的利用率。通过烟碱的生物调控技术处理烟叶不仅能够减少烟叶在仓库中的陈化发酵时间，降低包括烟碱、蛋白质和亚硝胺等有害物质的含量，还可在不破坏烟叶抽吸品质的同时提高质量，防止烟叶受潮变质。

3 展 望

降低烟草废弃物中烟碱的含量，减少烟碱对环境的危害，是烟草废弃物资源化处理的首要任务。微生物对烟碱的耐受性极高，可将烟碱作为碳、氮和能量的唯一来源，通过不同的代谢途径将烟碱降解为低危害或可再利用的无害物质。

目前烟碱生物调控技术仍有许多问题有待解决，如生物调控技术多侧重于微生物调控，其他调控技术还有待发现；微生物种类和降解途径繁多，没有系统的数据库进行归类汇总；缺乏纵向的深入研究，调控机制尚不完全清晰等。在未来的研究中，可通过观察卷烟生产过程中各时期微生物的变化，探寻合适的微生物制剂施用时间和施用方法，为微生物在烟草中的合理利用提供更加可靠的技术支持；对烟碱的生物调控代谢机制研究可通过酶学和分子生物学技术找到关键酶及其基因，并通过基因工程对相关基因进行克隆、编辑和修饰等，使生物调控烟碱的能力提高；随着基因组学的不断发展，可通过基因组学探索除微生物外更多关于烟碱降解的生物技术。综上所述，烟草废弃物中烟碱生物调控技术的开发与应用具有很大的发展潜力和应用前景，能够为烟草生产加工以及生态环境保护提供技术支持。