王恩莹 晁琳珂 郝素晓 卢艳芬 姚允聪

摘要 探究GID2基因在调控植物生长发育方面的作用机制。从苹果矮化砧木“SH6”中克隆到GID2-1和GID2-2基因，运用MEGA7、SWISS-MODEL、DNAMAN 7.0等生物信息学工具分析其序列、蛋白质结构;通过qRT-PCR分析GID2-1和GID2-2基因在不同激素处理下的表达情况。序列分析表明，GID2-1基因的CDS序列长度为591 bp，GID2-2为597 bp，分别编码196、198个氨基酸的蛋白质;GID2基因具有F-box结构域。qRT-PCR分析表明，在GA处理下，表达量下调;相反，在PAC处理下其表达量上调。结果表明，GID2基因可能在苹果生长发育方面发挥重要作用。

关键词 SH6;GID2;生长发育;生物信息学;赤霉素

中图分类号 Q943.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）09-0104-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.026

Abstract In order to explore the mechanism of GID2 gene in regulating plant growth and development. The GID2-1 and GID2-2 genes from the apple dwarf rootstock “SH6” were cloned， and their sequence and protein structure were analyzed using bioinformatics tools such as MEGA7， SWISS-MODEL， DNAMAN7.0. The expression of GID2-1 and GID2-2 genes under different hormone treatments was analyzed by qRT-PCR. Sequence analysis showed that the CDS sequence of GID2-1 gene was 591 bp in length，GID2-2 was 597 bp， respectively encoding a protein of 196， 198 amino acids;GID2 gene had F-box domain. qRT-PCR analysis showed that the expression level was down-regulated under GA treatment;on the contrary， its expression level was up-regulated under PAC treatment. The results indicated that GID2 gene may play an important role in apple growth and development.

Key words SH6;GID2;Growth and development;Bioinformatics;Gibberellin

赤霉素（GA）是植物生長发育过程中不可或缺的一类重要植物激素，影响植物许多发育过程，包括种子萌发、茎伸长、花粉成熟和诱导开花等方面[1]。在20世纪60年代，赤霉素对植物株高的影响较大，在“绿色革命”期间，半矮化品种的发展表明了赤霉素响应信号途径的改变导致粮食产量的巨大增加[2]。随着赤霉素信号途径元件的克隆与表达分析，赤霉素信号通路的大部分成分已经在水稻和拟南芥中鉴定出来，主要包括GA受体GID1、生长抑制蛋白DELLAs和F-box蛋白（拟南芥为SLY1，水稻为GID2）[1]，研究表明，DELLA蛋白对植物生长具有负调控作用，GA信号通过克服DELLA蛋白介导生长的抑制作用来促进植株高度[3]，并提出了GA-GID1-DELLA复合物来感知GA信号从而调控植物生长的机制[4-6]。

赤霉素如何抑制DELLAs成为研究的一个热点，研究表明通过对功能缺失突变体gid2-1和sly1-10的GA不敏感矮化表型的分析，发现水稻中GID2蛋白和拟南芥SLY1蛋白均含有F-box保守结构域，其是GA信号转导过程中的正调控因子[7-8]，通过催化多泛素链附着到DELLA蛋白上，从而使26S蛋白酶体降解DELLA蛋白，消除其对植物生长的抑制作用[9]。当GA浓度较低时，DELLA蛋白与转录因子或调节蛋白相互作用阻碍GA信号转导过程，或者激活与转录因子（TF）相关靶基因的转录过程。当GA浓度升高后，GA与其受体蛋白GID1相结合，识别DELLA蛋白，形成GA-GID1-DELLA复合物，诱导DELLA蛋白GRAS结构域的构象发生改变，从而使其DELLA的VHIID和LHRII基序识别F-box蛋白SLY1/GID2[10]。同时SCFSLY1-GID2复合物反过来促进DELLA蛋白被多泛素化，然后经26S蛋白酶体降解，从而响应GA反应[7-8，11-13]。

苹果属植物采用矮化密植方式，有利于管理[14]，结果早，果实品质好。我国果树生产中经常采用的主要致矮方式是应用矮化中间砧木[15-17]。“SH6”矮化砧木是由国光苹果与武乡海棠的芽变种S19杂交得到的一种优良苹果半矮化中间砧木，与亲本相比较，“SH6”在株高、枝皮率、尖削度、节间长度等方面具有更稳定的抗性及矮化优势[18]。研究发现，在SH6系幼树的中间砧部位进行培土，可以促进树体的营养生长[19]。为了详细阐明果树矮化调控机理，国内外众多研究者对果树矮化栽培育种开展了广泛研究，但目前对其分子机理研究尚不清晰。因此，研究在GID2基因调控下半矮化中间砧木“SH6”的生长发育，为研究GA信号转导途径相关基因的分子机制提供理论依据，对调控果树生长发育过程具有极其重要的意义[20]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以苹果属植物“SH6”（Malus sp.SH6）為材料，自北京农学院组培中心采样，选取植物叶片进行试验。冷冻于液氮中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1.2.1 苹果属植物GID2基因克隆。

RNA的提取：称量0.1 g冻存于-80 ℃的植物叶片，采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司，北京）提取“SH6”叶片的总RNA。

合成cDNA：利用cDNA合成试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司，日本）将提取的‘SH6叶片总RNA反转录生成cDNA。

引物的设计与合成：根据NCBI公布的苹果同源基因MdGId2-1（XP_028962684.1）、MdGID2-2（XP_008393765.1），利用Editseq工具设计引物，序列见表1。

基因克隆PCR反应体系（50 μL）：cDNA模板2 μL;GID2-F（10 μmol/L）1 μL;10 μmol/L（GID2-R）1 μL;TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase（北京全式金生物公司，北京）25 μL;H2O 21 μL。

基因克隆PCR反应条件：95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

PCR产物纯化回收，连入pEASY-Blunt Cloning Vector载体后，转入Trans T1大肠杆菌感受态细胞（北京全式金生物公司，北京）进行转化子鉴定，选取5个阳性克隆进行测序。

1.2.2 GID2基因的生物信息学分析。

利用ProtParam网页在线分析工具计算蛋白质理化性质，如等电点、分子质量等信息，预测其蛋白质的疏水性功能;利用DNAMAN 7.0对检索到的相关基因的氨基酸序列进行同源性分析;利用TMHMM工具与SignalP4.0工具分析跨膜结构和信号肽;利用NPS@的SOPMA工具对GID2-1和GID2-2二级结构进行预测;利用NCBI CD-search分析蛋白质保守结构域;利用SWISS-MODEL工具预测分析蛋白质的三级结构;利用MEGA 7序列比对软件构建系统进化树。

1.2.3 GID2基因在不同激素处理中的表达分析。

在“SH6”组培苗正常生长至三叶期，对其进行不同激素处理：正常的MS培养基中，分别加入10 μmol/L的PAC与50 μmol/L的GA。处理后20 d取样，用于基因表达分析。使用植物RNA提取试剂盒提取“SH6”叶片总RNA。反转录合成cDNA，使用CFX96TM Real Time PCR System进行qRT-PCR试验。

qRT-PCR反应体系（50 μL）：cDNA模板2 μL;qGID2-F（10 μmol/L）1 μL;qGID2-R（10 μmol/L）1 μL;2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL;H2O 6 μL。

qRT-PCR反应条件：95 ℃ 10 min;95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30个循环;72 ℃ 2 min;4 ℃ 保存。

取3个生物学重复，并进行3次独立的试验。并通过使用Malus 18S核糖体RNA基因作为内参基因的相对定量来测定转录水平。

1.3 数据处理

采用Excel 2007和SPSS软件对试验结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 “SH6”植物叶片GID2基因克隆

以苹果属植物“SH6”叶片的cDNA为模板，克隆GID2基因，利用琼脂糖凝胶电泳的方法，检测得到目的条带（图1）。

回收纯化目的条带后，将其连接到Blunt载体上，挑选单克隆进行菌落PCR，选择阳性菌测序。测序结果显示，“SH6”中GID2的CDS序列全长分别为GID2-1长591 bp，编码196个氨基酸;GID2-2长597 bp，编码198个氨基酸。

2.2 苹果属植物“SH6”GID2基因序列分析

利用ProtParam在线分析软件对预测氨基酸序列信息发现GID2-1蛋白的等电点是7.70，分子量为21 kD，是不稳定的蛋白质，其不稳定系数达58.35，亲水性值为-0.412（预测为亲水性蛋白质）;GID2-2蛋白的等电点是7.67，分子量是21 kD，是不稳定蛋白质，不稳定系数达62.92，亲水性值为-0.448（亲水性蛋白质）。利用DNAMAN7.0软件对“SH6”GID2基因的CDS区进行同源性比较，结果表明，GID2-1和GID2-2同源性为87.18%（图2）。TMHMM和SignalP4.0结果分析显示GID2-1和GID2-2均没有跨膜结构和信号肽（图3）。

通过NPS@的SOPMA工具对GID2-1和GID2-2二级结构进行预测，发现GID2-1蛋白中α-螺旋比例占54.08%，延伸链占比3.57%，无规则卷曲占比40.31%，β-转角最少仅占比2.04%;GID2-2蛋白中α-螺旋占比50.51%，无规则卷曲占比39.39%，延伸链占比6.06%，β-转角仅占比4.04%（图4）。

2.3 GID2蛋白保守结构域与三级结构预测分析

利用NCBI CD-esarch对GID2-1和GID2-2蛋白的保守结构域进行预测分析，发现GID2-1和GID2-2蛋白均含有F-box保守结构域，F-box保守结构域是SCF复合体的亚基，参与蛋白质泛素化降解过程。进一步利用SWISS-MODEL在线分析软件对GID2-1和GID2-2进行同源建模预测其三级结构含有F-box蛋白结构域，其保守结构域和二级结构预测分析结果一致（图5、6）。

2.4 系统进化结果分析

通过MEGA 7.0工具构建系统进化树，比对克隆得到的GID2-1和GID2-2蛋白與NCBI中检索到的其他物种的同源蛋白，发现GID2-1和GID2-2基因分别与苹果的GID2基因聚类在同一分支上，亲缘关系最近。这说明GID2蛋白可能在赤霉素信号转导途径中发挥作用，参与调控植物生长发育（图7）。

2.5 GID2基因在不同激素处理中的表达分析

通过qRT-PCR检测在MS、GA、PAC 3种不同处理下“SH6”叶片基因表达水平。结果表明，在GA处理下，GID2-1和GID2-2基因表达量显著下降，在PAC处理下，GID2-1和GID2-2基因表达水平显著升高。这一结果证明GID2基因确实调控GA信号转导过程（图8）。

3 讨论

赤霉素（GA）作为一类调控植物株型的重要植物激素，在茎的伸长、种子萌发及果实发育等方面中扮演着重要角

色。目前已有大量研究表明，水稻、拟南芥等植物中已经发现赤霉素信号转导途径的相关元件，包括GA的受体蛋白GID1、负调控因子DELLA蛋白以及F-box蛋白GID2和SLY1。当GA浓度较低时，DELLA蛋白对植物的生长发育过程产生抑制作用。相反，当GA浓度升高时，GA与受体蛋白GID1相结合，与DELLA蛋白相互作用，三者之间形成了GA-GID1-DELLA复合物，被SCFSLY1/GID2复合物识别并催化，导致DELLA蛋白的泛素化，最终被26S蛋白酶体降解，从而下游信号转导过程被激活，调节植物株高。GA信号转导途径中关于株高相关基因的克隆分析与分子机制研究，对探究如何调控植物生长发育具有极其重要的参考意义，为农业生产实践提供了理论依据。

从苹果矮化中间砧木“SH6”叶片中分离得到CDS全长为591 bp的GID2-1和全长为 597 bp 的GID2-2基因，分别编码196、198个氨基酸。进一步分析发现GID2-1与GID2-2的CDS序列同源性高，其蛋白质结构具有F-box保守结构域。系统进化树分析GID2蛋白与Malus domestica中的GID2蛋白亲缘关系较近，且与拟南芥的SLY1蛋白在进化中有相同起源。“SH6”的GID2基因在不同处理下的表达水平显示其参与GA信号调控。因此推测其可能具有调控植物生长发育的作用。

该研究克隆和分析了“SH6”中的GID2-1和GID2-2基因，探究在不同处理下GID2-1和GID2-2基因表达的影响，有助于深入研究GID2蛋白在调控苹果株高的分子机制，为“SH6”作为苹果矮化中间砧木的应用奠定理论基础。

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