APP下载

新型99mTC标记三苯基磷线粒体膜电位示踪剂的研究

2021-06-22武香香李晓芳王国强宋军营谢治深张紫娟乔永辉谭晓柯许段杰严银银曾华辉张振强

河南大学学报(医学版) 2021年3期
关键词:心肌细胞放射性线粒体

武香香,朱 鑫,闫 敏,袁 永,李晓芳,王国强,宋军营,谢治深,张紫娟,胡 锴,乔永辉,谭晓柯,许段杰,严银银,曾华辉,张振强

河南中医药大学 中医药科学院,郑州450046

线粒体功能障碍广泛存在于心脏病、动脉粥样硬化、中风、糖尿病、癌症及退行性疾病等多种疾病中[1]。现已有许多方法用于评估线粒体功能障碍及其功能,如使用分离的线粒体、完整细胞、原位技术等[2-3]。分离线粒体分析已广泛建立,并用于线粒体功能的定量和定性评价,通常需要大量非细胞环境及用于特定目的的适当实验条件的线粒体样本。完整细胞分析能在未受干扰的细胞环境中评估线粒体,但经常受到渗透性能差的试剂和培养基的限制,导致线粒体不能直接接触到胞外基质和抑制剂及细胞与细胞的相互作用。因此,这些方法在直接研究体内线粒体功能障碍及其功能方面有很好的应用前景。

线粒体在心肌细胞(MCM)凋亡过程中起着至关重要的作用,是一个高度调节的多步骤过程。线粒体控制的凋亡途径通常伴随着线粒体膜通透性改变和线粒体膜电位(ΔΨm)丧失,可以通过膜电位示踪剂来测量[4],例如罗丹明-123、3H-四苯基膦(3H-TPP)和99mTc-2-甲氧基异丁基异腈(99mTc-MIBI),因其优先在心肌细胞中的定位而被用来测定心肌ΔΨm[5-8]。这些亲脂性的阳离子能够被动扩散到心肌细胞的细胞质和线粒体中,以响应大量的细胞质膜负电位(ΔΨp)和线粒体膜负电位。然而,罗丹明-123 由于其荧光淬灭很难准确定量。此外,由于氚具有很长的半衰期(12.43 a),因此,3H-TPP 仅用作体外探针来测量ΔΨm。99mTc-MIBI 最初是作为心肌灌注单光子发射断层扫描(SPECT)示踪剂开发的,后来发展为肿瘤示踪剂[9]。然而,99mTc-MIBI在肺和肝脏中的高积累量会干扰心肌血流异常的检测,故发展应用于临床的SPECT 敏感膜电位示踪剂是很有必要的。

最近报道了一系列18F 标记的三苯基磷化合物作为探针,用于评估体内/外的ΔΨm[10-12]。我们以前开发了一种18F 标记的三苯基磷酸阳离子([18F]-TPMP),用PET 对心肌疾病进行无创性评估,突出了该探针在阐明线粒体功能障碍的发病机制方面的潜力[13]。然而,这些示踪剂有一定程度的脱氟,造成其放射化学产率很低。本文报道99mTc 标记的三苯基磷阳离子(99mTc-CHT)作为一种新型膜电位示踪剂,用于研究啮齿类动物的心肌细胞膜电位。

1 材料与方法

1.1 材料

Bioscan System 200 薄层色谱(Washington,DC,USA);配备有UV 检测器和放射性同位素检测器的半制备高压液相色谱系统(HPLC);放射性活度计(CRC-15R,Capintec)。

Na99mTcO4是从99Mo-99mTc 发生器(北京原子高科技有限公司,北京)用生理盐水洗脱获得。Sprague-Dawley 大鼠(250 g±10 g)由上海Slac 实验动物有限公司提供。

1.2 线粒体的药物摄取实验

从3 日龄乳鼠中分离提取原代心肌细胞。采集乳鼠心脏组织并立即浸入DMEM 完全培养基中。心脏组织用D-Hanks 的溶液冲洗两次,然后用刀片切成小块。心脏小块用0.25%胰蛋白酶溶液在37 ℃下溶解30 min,然后用力吸液并通过40 μm 筛网过滤。800 g 离心5 min 后,将颗粒重新悬浮在培养基中。所有细胞在37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养。

用99mTc-CHT 或其类似物99mTc-CHB (0.2~2 nmol/L)在DMEM 完全培养基中培养小鼠心肌细胞(106个)60 min,用细胞线粒体分离试剂盒分离MCM 线粒体。简单地说,从培养皿中收集MCM,并用PBS 洗涤三次,然后重悬在1 mL 线粒体分离液中。细胞在冰浴中匀浆,800 g 离心10 min。收集沉淀,将上清液转移到另一个试管中,11 000 g离心10 min。沉淀作为细胞线粒体收集,并收集溶液。用γ 探测器对收集到的各成分的放射性进行计数。

1.3 电位依赖性摄取

99mTc-CHT 在心肌细胞中的摄取:①在DMEM 完成培养基中,用99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 孵育MCM。将等分试样转移到含有胎牛血清的试管中,在不同时间终止摄取,并离心10 min;②MCM 在不同浓度的99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 缓冲液中培养。60 min 后进行摄取测定;③在加入99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的前10 min,将MCM 在钾盐缓冲液、CCCP(羰基氰基氯苯腙)和鱼藤酮中培养,考察去极化剂对膜电位的影响。在60 min 时收集细胞,离心10 min,检测颗粒和上清液的放射性活性,方法如上所述。

1.4 放射自显影法

用SD 大鼠(250 g±2 g)进行冠状动脉结扎制备急性心肌梗死模型。大鼠左冠状动脉前降支结扎24 h 后解开,随后使用PET [18F]-FDG 对心肌梗死大鼠模型进行评估。模型鼠经尾静脉注射99mTc-CHT(10 mCi),30 min 后所有大鼠用过量的戊巴比妥处死,收集心脏、洗净、冰冻切片成1 mm 厚(CM1900,Leica),然后进行15 min 放射自显影。在储磷屏系统中(Perkin-Elmer Inc)中进行显影。

2 结果

成功制备99mTc-CHT 和99mTc-CHB,总放射化学产率为40.7%~50.1%(n=5,衰变校正);两种99mTc标记产物的放化纯度均大于99%,比活度约为235 Ci/mmol。纸电泳证实99mTc-CHT 为阳离子,99mTc-CHB 为中性离子。见图1。

图1 99mTc/Re-CHT 和99mTc/Re-CHB 的合成过程

99mTc-CHT(32.54%±3.11%)在细胞内的放射性高于99mTc-CHB(28.13%±2.24%);99mTc-CHT 在细胞和线粒体中的浓度分别为(2.06%±0.31%) μL-1和(2.82%±0.28%) μL-1。见表1。表明99mTc-CHT 能穿过细胞膜和线粒体膜。在线粒体中,99mTc-CHT 的放射性含量和浓度(18.84%±2.17%,2.82%·μL-1±0.28%·μL-1)均高于99mTc-CHB(5.06%·μL-1±1.21%·μL-1,0.76%·μL-1±0.09%·μL-1);99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 加入培养液与细胞共同孵育60 min 后,细胞内药物达到平台浓度,分别为37.8%·μL-1±1.3%·μL-1和35.7%·μL-1±1.7%·μL-1。

表1 小鼠心肌细胞及其线粒体中99mTc 复合物的放射性剂量,其结果用于总放射性剂量的占比百分数(%)和浓度(%μL-1)表示

99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 均与钾离子浓度呈近似平行的反向线性关系。计算了99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 回归曲线的相关系数(R2=0.997,0.999)和斜率(-0.24,-0.22),见图2。

图2 99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 细胞摄取与细胞外钾离子浓度的关系

我们发现99mTc-CHT(减少81.7%)和99mTc-MIBI(减少76.2%)的细胞摄取有类似的剂量依赖性。在含有高K+(100 mmol/L)和缬氨霉素(1 μg/mL)的含MCM 培养液中,99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的细胞摄取量分别下降了81.1%和82.2%,见图3A。而在含鱼藤酮(1 μmol/L)的MCM 培养液中,99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的细胞摄取量分别降低77.9%和75.9%,见图3B。

图3 99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 在小鼠原代心肌细胞中的时间依赖性(A)和浓度依赖性(B)积累

CCCP 和鱼藤酮存在的条件下,CCCP 的浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、5、100 μmol/L 下99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的细胞摄取逐渐减少见图4A。用高浓度K+、缬氨霉素和鱼藤酮使膜电位去极化后99mTc-CHT和99mTc-MIBI 的细胞摄取也明显减少,见图4B。

给药30 min 后,对心肌梗死SD 大鼠心脏冰冻切片进行放射自显影研究。健康心肌的高放射性摄取以及缺血心肌(白箭头)的极低摄取,见图4。

图4 膜电位改变对99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 细胞摄取的影响

3 讨论

环戊二烯基三羰基99mTC 通过己酰基间隔基与三苯基磷共轭形成放射性示踪剂99mTc-CHT(见图1)。即6-溴己酸与过量的二氯亚砜反应生成中间体2,然后与二茂铁在AlCl3存在下进行傅-克酰基化反应生成3,然后与三苯基磷在乙腈中反应得到4。前体(3 或4)在NH4ReO4/Na99mTcO4,CrCl3和Cr(CO)6存在下进行双配体转移反应生成最终产物Re/99mTc-CHB(7/8)或Re/99mTc-CHT(5/6)。通过质谱和核磁共振鉴定所得化合物的结构,与预测的结构相一致。总放化产率为40.7%~50.1%(n=5,衰变校正);两种99mTc 标记产物的放化纯度均大于99%,比活度约为235 Ci/mmol。纸电泳证实99mTc-CHT为阳离子,99mTc-CHB 为中性离子。

细胞和线粒体对示踪剂的摄取能力通常用ICP-MS 或荧光光谱法检测。但由于示踪剂的分离纯化过程复杂,质谱分析法可能难以精确测量示踪剂。荧光示踪剂很难定量,由于摄取饱和及随后的猝灭,常常无法检测到电位的巨大变化。放射性标记的磷离子易于定量,且对膜电位的响应范围很大。放射性核素99mTc 也可用来测定细胞和线粒体中99mTc-CHT 的相对含量。

为了确定99mTc-CHT 是否具有线粒体靶向性,以99mTc-CHB(没有TPP 基团)为参照物进行实验。各示踪剂在细胞和线粒体中的积累有显著差异,具体数据见表1。显然,99mTc-CHT(32.54%±3.11%)在细胞内的放射性高于99mTc-CHB (28.13% ±2.24%),表明细胞中99mTc-CHT 的含量高于99mTc-CHB。99mTc-CHT 在细胞和线粒体中的浓度分别为(2.06%±0.31%) μL-1和(2.82%±0.28%) μL-1,表明99mTc-CHT 能穿过细胞膜和线粒体膜。在线粒体中,99mTc-CHT 的放射性含量和浓度(18.84% ±2.17%,2.82%±0.28%)均高于99mTc-CHB(5.06%±1.21%,0.76±0.09%),表明99mTc-CHT 对线粒体有很强的亲和力和靶向性。这表明99mTc-CHT 可以穿过细胞膜,并在细胞质中积累,然后再进入线粒体。相较于99mTc-CHB,心肌细胞更易被99mTc-CHT渗透,预示TPP 具有线粒体靶向性并更易积累99mTc-CHT。

参照99mTc-MIBI,我们研究了99mTc-CHT 在小鼠心肌细胞(MCM)的摄取动力学。图3A 显示了99mTc-CHT和99mTc-MIBI 的细胞摄取成典型的时间依赖性。99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 加入培养液与细胞共同孵育60 min 后,细胞内药物达到平台浓度,分别为37.8%±1.3%和35.7%±1.7%。图3B 显示了细胞摄取率与胞外99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 浓度的关系。99mTc-CHT和99mTc-MIBI 在细胞摄取-浓度关系直方图上的累计率无明显差异。两种细胞摄取值在0.05~1 μCi 的浓度范围内相当稳定,但在50 μCi 时显著下降。因此,应在99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 浓度范围在0.05~1 μCi 以内且孵育60 min 后进行摄取测定。

细胞凋亡线粒体途径的特点是:线粒体外膜通透性变化前、中、后,线粒体膜电位逐渐下降直至消失。膜电位的改变可以被亲脂性阳离子如99mTc-MIBI、3H-TPP 和罗丹明-123 检测出来,这些物质主要集中在线粒体基质中,反映正常的线粒体膜电位,反之则表示膜电位异常或线粒体去极化。因此,在两种条件下,检测了MCM 摄取99mTc-CHT 作为驱动力的膜电位:①通过改变细胞外介质的钾离子浓度,可以逐步降低膜电位;②线粒体和血浆膜电位的消失。羰基氰化氯苯腙(CCCP,一种线粒体代谢抑制剂)通过选择性地消除线粒体内膜电位实现与线粒体的解偶联。以鱼藤酮(电子转移链Ⅰ位点的特异性抑制剂,能诱导线粒体膜电位的消散)作为阳性对照。随着胞外介质中钾离子浓度的增加,膜电位成比例下降,示踪剂的电位依赖性摄取也会随之降低。因此,在钾离子浓度逐步增加(从10 到100 mmol/L)的情况下,在MCM 中进行摄取测定。图2显示了六种钾浓度下的细胞相关活性。99mTc-CHT和99mTc-MIBI 均与钾离子浓度呈近似平行的反向线性关系。相关系数代表示踪剂测量膜电位的准确性。回归曲线的斜率表示示踪剂对电势梯度变化的敏感性。计算了99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 回归曲线的相关系数(R2=0.997,0.999)和斜率(-0.24,-0.22)。99mTc-CHT 在灵敏度和准确度方面的性能与文献记载的膜电位示踪剂99mTc-MIBI 几乎相同。

在CCCP 和鱼藤酮存在的条件下,对这些亲脂性阳离子进行另一项电位依赖性细胞摄取试验。图4A 显示了在CCCP 不同浓度下,99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的细胞摄取情况,证明细胞相关活性呈剂量依赖性降低,对MCM 最有效的CCCP 浓度为10 μmol/L。我们发现99mTc-CHT(减少81.7%)和99mTc-MIBI(减少76.2%)的细胞摄取有类似的剂量依赖性。在含有高K+(100 mmol/L)和缬氨霉素(1 μg/mL)的含MCM 培养液中,99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的细胞摄取量分别下降了81.1%和82.2%(见图4B)。而在含鱼藤酮(1 μmol/L)的MCM 培养液中,99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的细胞摄取量分别降低77.9%和75.9%(见图4B)。相比照组,在CCCP(10 μM)、高K+和缬氨霉素、鱼藤酮存在下,99mTc-CHT 和99mTc-MIBI 的细胞摄取量降至6.9%~8.5%,表明线粒体受损严重、线粒体膜电位消散。研究表明,亲脂性磷离子摄取中的80%是由线粒体膜电位决定的,约10%是由血浆膜电位决定的。在线粒体膜电位和血浆膜电位同时崩解的情况下,仍有10%的放射性活性与膜电位无关,其细胞结合活性为非特异性。因此,99mTc-CHT细胞摄取与膜电位尤为相关,特别是线粒体膜电位。而且99mTc-CHT 对电位变化的敏感性比99mTc-MIBI稍微强一些。所有这些特征表明,99mTc-CHT可以为检测线粒体内ΔΨm提供一种灵敏的电位示踪剂。

给药30min 后,对心肌梗死SD 大鼠心脏冰冻切片进行放射自显影研究。图5 显示了健康心肌的高放射性摄取以及缺血心肌(白箭头)的极低摄取。结果表明,由于缺血心肌细胞线粒体膜电位消散,99mTc-CHT 进入死亡心肌细胞难度很大,说明99mTc-CHT通过膜电位依赖的方式或线粒体特异性在心肌细胞中聚集。综上所述,我们开发的99mTc 标记三苯基磷阳离子:99mTc-CHT,显示出三苯基磷阳离子疏水性与其结构中离域电荷的适当平衡。它使探针成为一种可在体内和体外评估ΔΨm的灵敏线粒体膜电位示踪剂,其性能与99mTc-MIBI 相当或稍优越。99mTc-CHT 可以作为潜在的膜电位示踪剂,应用于与线粒体功能障碍相关的心肌疾病的诊断。

图5 心肌梗死大鼠心脏切片的放射自显影图

猜你喜欢

心肌细胞放射性线粒体
从线粒体动力学探讨中医药治疗心力衰竭相关机制研究
线粒体自噬在肠缺血再灌注损伤中的作用及机制研究进展
线粒体自噬在纤维化疾病中作用的研究进展
矿产资源开发利用放射性固体废物数据库管理系统
乌克兰两处放射性废物处理设施受损尚未造成放射性泄露
核电站放射性废物太空处置的可行性分析
华龙一号蒸汽发生器传热管6mm破口事故放射性后果分析
circPRKCI靶向miR-217对缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤的影响
布托啡诺通过调控miR-665表达对脂多糖致心肌细胞炎症反应及细胞凋亡的影响
新生SD大鼠心肌细胞原代培养方法的比较