王雅芝，张建永，段灿灿

（1.遵义医科大学药学院，贵州遵义 563000；2.遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州遵义 563000）

肝脏是人体内最大的腺体，在人的代谢、胆汁生成、解毒、免疫等过程中均起着非常重要的作用，是人体内的一个巨大“化工厂”。随着我国人民饮食结构和生活环境的改变，饮酒逐渐增多，酒精性肝病（Alcoholic liver disease，ALD）等肝病的患病率正在迅速增加[1]。目前，西药在治疗ALD 等肝病具有一定作用，但仍存在一定的毒副反应[2]，中药方剂在治疗肝病上有悠久的历史，具有多成分、多靶点、多环节综合作用的特点，且安全性较高。因此，从复方中药，特别是药食两用中药中挖掘治疗ALD 等肝病的药物称为当下的热点。

益肝草凉茶是贵州省贵定县非物质文化遗产饮品，其主要成分由栀子、甘草、枸杞子、大枣、葛根、苦丁茶、鱼腥草、覆盆子、蒲公英组成，具有解酒保肝的作用，尤其可以明显缓解酒后常见的胃肠不适、口干、恶心、头痛等症状。现代药理学研究发现益肝草凉茶能够提高小鼠乙醇脱氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活性，清除自由基、降低小鼠血清中乙醇、乙醛的含量，达到解酒保肝的效果[3]。然而益肝草凉茶中化学成分复杂，其解酒保肝的有效成分及相应的作用机制尚不清楚。

网络药理学（Network pharmacology）是以系统生物学和生物信息学为基础，其可通过药物改善或恢复生物网络平衡的角度来认识药物与机体间的作用关系。现代网络药理学的研究策略与复方中药从整体和系统方面治疗疾病的的特点具有相通性，为传统复方，如半夏泻心汤、清热利胆汤等中药药效物质基础及作用机制研究提供了新的手段[4-7]。因此本研究拟采用网络药理学的方法，从靶点预测、网络分析及分子对接深入揭示了益肝草凉茶解酒保肝作用的药理机制，如图1 所示。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）；中医药综合数据库（TCMID）；中药分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM）；PubChem 数据库；SwissTargetPrediction 数据库；TargetNet 数据库；UniProt 数据库；比较毒理基因组学数据库(CTD)；功能关联蛋白网络数据库（STRING）；生物学信息注释数据库（DAVID）；RCSBPDB 数据库；Cytoscape 3.7.1 软件；AutoDock 软件。

1.2 实验方法

1.2.1 化学成分收集与筛选 本研究运用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），以甘草、枸杞子、大枣、栀子、苦丁茶、鱼腥草、覆盆子、葛根为关键词，检索8 味中药的全部化学成分；运用中医药综合数据库（TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）、中药分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）结合文献报道[8-9]查找蒲公英中的化学成分。以化合物口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 作为活性成分的筛选条件，筛选出9 味中药的活性成分。

1.2.2 靶点的预测与构建 通过PubChem 数据库下载活性成分的化学结构，其中PubChem 数据库未收录的成分，运用ChemDraw 软件进行画图，将所有活性成分保存为SDF 格式文件，并上传SwissTarget Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库获取每个成分对应的SMILES 号，然后上传TargetNet（http://targetnet.scbdd.com/calcnet/index/）数据库进行靶点预测，以AUC≥0.7、预测概率（Prob）＞0.9 作为筛选条件，预测得到益肝草活性成分的相关靶点。采用Cytoscape3.7.1 软件构建“中药-成分-靶点”网络，进一步采用Networkanalysis 插件对网络特征指标度（degree）和介数（Betweenness）进行分析，筛选出益肝草凉茶的关键活性成分。

1.2.3 疾病靶点的筛选与构建 通过UniProt（https://www.uniprot.org/）数据库，限定物种为“Homo sapiens”，校正靶点为标准基因名，得到益肝草凉茶作用于人源的有效靶点。将有效靶点导入CTD 数据库（https：//ctdbase.org/tools/batchQuery.go）中进行相关疾病的深入分析，筛选出与肝病相关的疾病靶点。

1.2.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建与分析 基于STRING 平台将所获取的疾病靶点导入数据库，获取蛋白间的相互作用关系，将结果保存成TSV 格式并导入Cytoscape 3.7.1 软件绘制相互作用网路，删除重复和孤立边，以节点（node）大小和颜色设置用于反映网络连接度（degree）的大小，边（edge）的粗细设置用于反映结合分数的大小，获得益肝草凉茶作用靶点蛋白-蛋白相互作用网络图。

1.2.5 靶点蛋白的基因功能与通路分析 为进一步分析靶点蛋白的基因功能及其参与的主要信号通路，利用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）在线数据库对PPI 网络中的作用靶点进行基因功能及信号通路富集分析，Select Identifier 设置为OFFICIALGENESYMBOL，List Type 设置为Gene List，限定物种为Homo Sapiens，获取作用靶点参与的主要信号通路，并使用ImageGP 在线平台对富集分析结果进行可视化分析，从而进一步了解益肝草凉茶的保肝作用机制。

1.2.6 整合核心网络分析 将上述的活性成分、作用靶点和靶点所富集的主要信号通路等信息整合到Excel 表格中，分别导入Cytoscape3.7.1 软件中，运用Merge 功能，将其合并得到中药-活性成分-作用靶点-主要通路的分析网络，从而进一步探讨益肝草凉茶解酒保肝作用的整体药理机制。

1.2.7 分子对接 采用AutoDock 软件对“中药-活性成分-作用靶点-主要通路”网络中度值前4 的靶点蛋白与关键成分进行分子对接验证，并用已上市的抗炎保肝药物[10]熊去氧胆酸胶囊（Ursodeoxycholic Acid Capules）、双环醇片(Bicyclol Tablets)进行对照分析。首先通过RCSBPDB（http://www.rcsb.org/）数据库获取靶点蛋白晶体结构，筛选条件如下：a.通过X-晶体衍射获得蛋白质结构；b.蛋白质的晶体分辨率小于3.5 μ；c.优先选择文献中报道与靶点蛋白相关的结构；d.该生物体为Homo sapiens。再利用AutoDock 对接软件将筛选出来的蛋白晶体结构去水加氢、对分子结构进行能量优化，分别保存为PDBQT 文件；运用OpenBabel 软件将关键成分及熊去氧胆酸胶囊、双环醇片的化学结构SDF 格式转化为PDB 格式。使用其插件AutoGrid 得到对接活性位点并计算格点能量，最后运用Pymol 软件对对接结果进行可视化分析。

2 结果与分析

2.1 化学成分筛选与靶点预测

本研究共收集到益肝草凉茶中化合物共1043 个。以OB≥30%和DL≥0.18 为筛选条件，化合物分子中有214 个符合条件，其中包括来自甘草93 个，来自枸杞子45 个，来自大枣15 个，来自栀子15 个，来自苦丁茶9 个，来自鱼腥草7 个，来自覆盆子7 个，来自蒲公英5 个，来自葛根4 个。经去除重复值得到186 个化合物，以C1-C186 命名，将其作为活性化合物。运用TargetNet 数据库进行靶点预测，选取得分在0.9 以上的靶点，共得到298 个靶基因。利用Cytoscape3.7.1 软件，将益肝草凉茶的9 味中药、186 个活性成分和298 个相关靶点建立可视网络拓扑图，如图2 所示。通过网络图中可以看出甘草和枸杞子中的活性成分较多，可能是益甘草凉茶中关键药味。度（degree）是网络节点中心性指标，节点度值越大表明节点的中心性越高。运用Network analysis 插件对网络特征指标进行分析，根据degree 值将排名前30 的活性化合物进行分析，如表1所示。其中degree 排名前10 的活性成分鞣花酸、没食子酸、槲皮素、油酸乙酯、二十碳五烯酸、香豆素、番红花酸、山柰酚、5-羟基-7-甲氧基-2-（3,4,5-三甲氧基苯基）色原酮和熊竹素作为益肝草凉茶中可能发挥作用的关键成分。根据degree 值对靶点的大小进行设置，靶点越大表明degree 值越大，其中degree 排名前10 的靶点主要是前列腺素G/H 合酶1（PTGS1）、多酚氧化酶2（PPO2）、花生四烯酸15 脂氧合酶（ALOX15）、诱导型一氧化氮合酶（NOS2）、碳酸酐酶6（CA6）、巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、Toll 样受体9（TLR9）、雌激素受体α（ESR1）、雌激素受体β（ESR2）和芳香化酶（CYP19A1）。上述靶点具有较多的作用配体，且Betweenness Centrality 相对较高，进一步说明这些靶点在益肝草凉茶保肝解酒网络环节中的重要性。

表1 中药-活性成分-靶点网络中度值排名前30 的化合物信息Table 1 Information of the top 30 compounds in the traditional Chinese medicine-active ingredient-target network

图2 中药-活性成分-靶点网络图Fig.2 Network diagram of traditional Chinese medicine-active ingredient-target

2.2 靶点-疾病网络的构建与分析

通过UniProt 数据库，校正靶点为标准基因名，得到益肝草凉茶中作用于人源的有效靶点有238 个。将筛选出来的有效靶点运用CTD 进行疾病相关分析，筛选条件P-Vaule≤0.01，筛选出与肝病相关的疾病有15 种，涉及78 个疾病靶点，如表2 所示。然后将上述靶点和益肝草凉茶中所含的每味中药进行归属，获得每味中药对应的靶点信息，采用TBtools 软件绘制Upset Plot[11-12]，如图3 所示。从图中左侧的条形图可以看出甘草的疾病靶点个数最高（Set size=65），再次证实甘草可能是益肝草凉茶中的关键药味。通过分析右侧点阵部分和上部分条形图发现，益肝草凉茶中9 味中药共有的疾病靶点有23 个，甘草特有的疾病靶点有6 个，苦丁茶和覆盆子特有的疾病靶点各1 个，并且各味中药之间均具不同数量的共同靶点，表明药味之间存在相互协同。

图3 疾病靶点在益肝草凉茶中9 味中药的分布图Fig.3 Distribution map of 9 traditional Chinese medicines in Yigancao herbal tea

表2 有效靶点作用于肝病的信息Table 2 Information of effective targets acting on liver disease

2.3 PPI 网络的构建与分析

将上述78 个疾病靶点导入STRING 蛋白互作数据库，限定来源为Homo sapiens，选择high confidence(0.9)，获取靶点之间相互作用关系，保存其TSV 格式文件并导入Cytoscape3.7.1 软件进行互作网络的拓扑学分析，共涉及48 个节点，84 条边，如图4 所示。其中节点表示蛋白，每条边表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系。以节点颜色深浅表示度值的大小，颜色越深代表该节点度值越大，表明该节点越关键。其中度值最高的两个靶点分别是淀粉样β 前体蛋白（APP，degree=11）和α-2B 肾上腺素能受体（ADRA2B，degree=8），说明这两个靶点是益肝草凉茶保护肝脏的关键靶点。

图4 靶蛋白PPI 网络Fig.4 Target protein PPI network

2.4 GO 生物进程分析和KEGG 通路富集分析

利用DAVID 在线数据库对益肝草凉茶的PPI网络中涉及的48 个作用靶点进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，以GeneRatio、P 值以及调控通路上的基因个数来衡量GO 和KEGG 富集程度，其中GeneRatio 代表基因的富集程度，P 值代表基因富集在每个条目的显著性差异。结果显示生物过程（BP）共得到175 个Go-terms，主要涉及氧化还原过程、血压负调节、磷脂酶C 活性的正调控、外源性药物分解代谢过程、对脂多糖的反应、胞浆钙离子浓度的正调节等相关生物进程；分子功能（MF）共捕获59 个Go-terms，主要涉及与酶结合、血红素结合、氧化还原酶活性、铁离子结合、蛋白激酶结合等方面；细胞成分（CC）共富集得到24 个Go-terms，主要涉及质膜、质膜的组成部分、胞浆、细胞内膜结合细胞器等方面。分别将BP、MF 和CC 根据P≤0.01 进行排序，各筛选出前10 个Go-terms 绘制气泡图，如图5A、5B、5C 所示。KEGG 分析共得到51 条信号通路，以P≤0.01 进行筛选，得到22 条富集程度较高的信号通路。包括癌症的途径（Pathways in cancer）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive ligandreceptor interaction）、5-羟色胺能突触（Serotonergic synapse）、cGMP-PKG 信号通路（cGMP-PKG signaling pathway）、鞘脂信号通路（Sphingolipid signaling pathway）等，如图5D 所示。

图5 活性成分相关靶点功能及通路注释分析Fig.5 Analysis of target function and pathway annotation of active components

2.5 成分-靶点-通路整合网络分析

将益肝草凉茶的活性成分、作用靶点和靶点所富集的主要信号通路等信息导入Cytoscape3.7.1 软件中，整合构建“中药-活性成分-靶点-通路”网络，直观地呈现出9 味药材、186 个活性成分、48 个作用靶点及8 条主要信号通路之间的关系，具体见如图6所示。该网络由247 个节点，1630 条边组成，从中可以看出甘草中的活性成分最多（degree=92），枸杞子次之（degree=45），可能是益肝草凉茶中的关键药味。进一步通过网络分析得知：有73 个活性成分可作用于10 个以上的靶点（degree≥10），说明它们在益肝草凉茶解酒保肝疗效中具有重要作用；在靶点中，诱导型一氧化氮合酶（NOS2）、前列腺素G/H 合酶1（PTGS1）、雌激素受体α（ESR1）、芳香酶（CYP19A1）的度值最高，分别是115、109、103、102；在信号通路中，Pathways in cancer、Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、Serotonergic synapse 这 4 条通路 的degree 排名靠前，可能是益肝草凉茶发挥解酒保肝作用的重要通路。所以说，益肝草凉茶的活性成分可作用于多个靶点，同时参与到多条信号通路中，构成了一个具有多成分、多靶点、多通路的整合网络。

图6 中药-活性成分-作用靶点-主要通路网络图Fig.6 Network diagram of traditional Chinese medicine-active ingredient-action target-main pathway

2.6 关键成分与4 种靶点蛋白的分子对接

为了进一步验证上述得到的关键成分和重要靶点的准确性，运用AutoDock 软件将“中药-活性成分-作用靶点-主要通路”网络中度值前4 的NOS2、PTGS1、ESR1、CYP19A1 分别与“活性成分-靶点”网络中筛选出来的10 个关键成分进行分子对接，选取熊去氧胆酸胶囊、双环醇片作为对照药，以自由结合能（binding energy）作为筛选条件，结合能越小表示对接结果越好，比较关键成分与对照药自由结合能的高低，判断其疗效。对于多构象的对接结果，筛选出结合能最低的对接构象，如表3 所示。通过表3分析得知，在PTGS1、ESR1、CYP19A1 中与关键成分的对接结果均强于两种阳性对照药，其中关键成分香豆素、番红花酸的对接结果最好。运用Pymol 软件，根据结合能的大小选出每个靶点蛋白对接最好的前2 位化合物进行可视化分析，结果如图7 所示。其中香豆素与NOS2、PTGS1、CYP19A1 均可以形成氢键，氢键键长分别是1.9、2.1/3.4、2.3/2.2/2.3，与靶点ESR1 未形成氢键；CYP19A1 与鞣花酸对接可以形成三个氨基酸残基，分别是SER-90、GLY-117、LYS-376，并且其结合能力高于对照药，表明它们是潜在的作用靶点。因此，根据分子对接技术对益肝草凉茶的关键成分与靶点蛋白结合能力分析，表明益肝草凉茶对肝脏具有保护作用，而且为其进一步研究提供理论依据。

图7 NOS2、PTGS1、ESR1、CYP19A1 与结合能排序最低的前2 位化合物的最佳对接构象Fig.7 The best docking conformation of NOS2,PTGS1,ESR1,CYP19A1 and the first two compounds with the lowest binding energy

表3 关键成分及对照药与NOS2、PTGS1、ESR1、CYP19A1 的结合能Table 3 Binding energy of key components and control drugs with NOS2,PTGS1,ESR1 and CYP19A1

3 讨论

天然药物作为我国的传统医药，历史悠久、资源丰富。中医古籍以及中医药现代研究发现许多单味药材和复方具有肝脏保护作用，如清热解毒利湿类的茵栀黄注射液、复方夏枯草、龙胆泻肝汤等；疏肝理气类的柴胡疏肝散、芍药甘草汤、逍遥散等；补肾健脾益气养血类的复方五仁醇胶囊、养阴软肝颗粒等；活血化瘀类的血府逐瘀汤、活络舒肝胶囊、赤芍、丹参、地龙等[13]。现代药理研究表明很多天然药物也能有效治疗或改善肝损伤疾病，如枸杞多糖[14]；蒲公英甾醇[15]；熊果酸[16]。益肝草凉茶共由9 味中药组成，具有清热解毒，补脾益气，护肝利胆，利尿，缓泻，退黄疸等功效，已在市场销售和使用。目前国内外学者对其单味药材的研究甚多，但9 味药材联合发挥作用的活性成分及作用机制尚不清楚，为了使益肝草凉茶能够合理应用及推广，让更多的消费者从中受益，对其深入研究具有重要意义。

本研究共发现了益肝草凉茶186 种活性成分，筛选出10 种可能发挥作用的关键活性成分，包括鞣花酸、没食子酸、槲皮素、油酸乙酯、二十碳五烯酸、香豆素等。鞣花酸具有明显的抗炎作用和抑制氧化应激的作用，可以用于治疗丙烯酰胺（ACR）引起的肝毒性，还可以通过降低了肝组织中NF-κB，TNF-α，IL-6 和COX-2 的表达对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）基因起到治疗作用[17-18]。同时鞣花酸和槲皮素可改善肝组织氧化还原状态，抑制肝脏纤维化相关基因的表达水平[19]；没食子酸能够有效地恢复细胞活力，减少乙醇刺激肝细胞释放天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶，尤其没食子酸还可以限制乙醇刺激下的肝细胞坏死，减少不同坏死信号受体相互作用蛋白1（RIP1）和RIP3 的表达，高迁移率族盒蛋白1 的释放[20]。槲皮素可以通过下调RNA 依赖性蛋白激酶样ER 激酶（PERK）起到保护肝细胞免受乙醇中毒的作用，降低饮酒后ALT、AST 的升高[21]。香豆素可通过激活Nrf2 信号通路从而保护ALD，并降低酒精性脂肪肝向肝癌的转化风险[22]，进一步验证了上述成分是益肝草凉茶发挥作用的主要药效物质基础。为了确证益肝草凉茶解酒保肝作用的药效物质基础，本研究采用分子对接技术对益肝草凉茶的关键成分与“中药-活性成分-作用靶点-主要通路”网络图的度值排名前四的靶点进行对接验证，以已上市的熊去氧胆酸胶囊、双环醇片作为对照药。结果显示，益肝草凉茶中的关键活性成分香豆素、番红花酸、鞣花酸等6 种对接后结合能优于对照药，再一次证实了益肝草凉茶对肝脏的保护作用，为治疗ALD 提供了科学依据。

通过进一步研究发现，上述活性成分可通过作用于前列腺素G/H 合酶1（PTGS1）、多酚氧化酶2（PPO2）、花生四烯酸15 脂氧合酶（ALOX15）、诱导型一氧化氮合酶（NOS2）、碳酸酐酶6（CA6）、巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、Toll 样受体9（TLR9）、雌激素受体α（ESR1）、雌激素受体β（ESR2）和芳香化酶（CYP19A1）等靶点发挥解酒保肝的作用。Zhang 等[23]发现ALOX15 基因敲除可通过减少氧化应激、内质网应激、脂质代谢紊乱和细胞死亡信号来预防ALD。MIF 是一种多功能细胞因子，参与机体对损伤后的炎症反应。研究表明发现抑制MIF 产生有助于治疗过度饮酒引起的肝损伤[24]。结合分子对接验证发现，PTGS1、NOS2、ESR1 和CYP19A1是潜在的作用靶点。NOS2 合成的NO 可以通过热休克蛋白70 家族（HSP70 家族）和血红素加氧酶1（Hmox1）的诱导提高肝细胞活力[25]。Khristi 等[26-27]发现ESR1 是肝脏的主要受体，ESR1 的丢失增加了雌性大鼠的体重增加和肥胖，并且ESR1 基因敲除（ESR1-/-）雄性大鼠的代谢紊乱与ESR1 在肝脏中转录调控的丧失有关。综上可知，益肝草凉茶正是通过“多成分-多靶点-协同作用”，实现其解酒保肝的功效。

基于STRING 交互作用网络数据库构建益肝草凉茶保肝作用靶点网络分析，结果显示其活性成分靶点蛋白间存在相互关系，是一个复杂交互的网络而并非单独起作用。GO 分析结果表明，益肝草凉茶活性成分作用的靶点主要富集在氧化还原过程、血压负调节、磷脂酶C 活性的正调控、外源性药物分解代谢过程、脂多糖介导的信号通路和胞浆钙离子浓度的正调节等生物学过程，涉及蛋白激酶、氧化还原酶、血红素、质膜、细胞内膜结合细胞器等多种物质的参与，是一个复杂的生物学过程。细胞膜受损是肝细胞受损的最基本表现，影响细胞正常生理功能；当细胞膜结构断裂时，大量的Ca2+内流，造成细胞肿胀，最终导致肝细胞死亡[11]。通路富集分析显示癌症的途径、钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、5-羟色胺能突触以及cGMP-PKG 信号通路等是益肝草凉茶作用的主要途径。在癌症途径中，共涉及靶点14 个，刘素彤等人[28]研究发现肝脏内有大量的免疫细胞，巨噬细胞可以通过介导内质网应激（ERS）分泌TNFα 促进NASH 恶性转化，主要原因是巨噬细胞的免疫M2 表型，M2 极化巨噬细胞常常存在于肿瘤微环境中，这与肿瘤进展密切相关。在钙信号通路中，共涉及11 个相关靶点，其靶点主要来自甘草中的活性成分，有文献报道钙信号转导失调可导致ROS 形成增加，线粒体去极化，最终导致肝细胞凋亡[29-30]；进一步研究发现肥胖小鼠或脂肪变性肝细胞中受损的钙信号显著加重肝脏脂肪变性[31]。中枢和外周神经系统是影响肝细胞色素P450（CYP）功能的重要因素，与重要靶点CYP19A1 密切相关，研究发现去甲肾上腺素能和5-羟色胺能系统也参与了肝脏CYP 的调节，同时多种神经递质（乙酰胆碱、肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺）对肝功能的影响及肝细胞色素氧化酶活性的生理调节也尤为重要[32]。以上研究表明，益肝草凉茶可通过上述成分、靶点、通路发挥解酒保肝的作用。

综上所述，本研究基于多成分、多靶点、多通路的研究思路，应用网络药理学技术，分析益肝草凉茶保肝作用靶点，构建益肝草凉茶保肝作用靶点的交互作用网络，通过分子对接技术验证网络关键节点，富集保肝作用相关的生物过程和通路，阐述并验证益肝草凉茶解酒保肝作用机制，为益肝草凉茶应用于临床应用提供科学可靠依据，同时也为研究其他复方中药提供了思路和方法。