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藏红花素对人宫颈癌Hela细胞顺铂耐药性的影响

2021-06-19姬白嫣杜小敬

新乡医学院学报 2021年5期
关键词:藏红花细胞周期空白对照

李 萍,姬白嫣,魏 娟,杜小敬,黄 凤

(邯郸市第二医院妇产科,河北 邯郸 056000)

宫颈癌是发病率和致死率均较高的妇科恶性肿瘤,虽然手术和放射治疗、化学治疗技术都取得了很大进步,但中晚期宫颈癌患者5 a生存率仍不足50%[1]。肿瘤细胞获得性耐药所致化学治疗敏感性降低是导致术后复发、转移的主要因素之一[2-3],因此,给予化学治疗耐药逆转剂可能是延长宫颈癌患者生存期的有效手段。藏红花属鸢尾科番红花属草本植物,为我国传统中药品种,具有活血化瘀、凉血解毒之功效。藏红花主要活性成分藏红花素具有较为广谱的抗肿瘤活性,对白血病、结直肠癌、前列腺癌、膀胱癌等均具有抑制作用[4]。近年来研究发现,藏红花素能够提高人肺腺癌A549细胞[5]、人胃癌BGC-823细胞[6]对顺铂治疗的敏感性。本研究以耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞为受试细胞,探讨藏红花素对人宫颈癌Hela细胞顺铂耐药性的逆转作用及相关机制,旨在为临床改善宫颈癌顺铂治疗的耐药性提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞耐顺铂人宫颈癌细胞系Hela/DDP购自中国科学院上海生物化学细胞所细胞库。

1.2 主要试剂与仪器藏红花素购自美国Sigma公司,注射用顺铂购自山东齐鲁制药有限公司(国药准字H20073652),达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)购自美国Hyclone公司,胰蛋白酶、胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)购自南京立乔生物科技有限公司,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒购自南京恩晶生物有限公司,碘化丙啶(propidium iodide,PI)购自美国Sigma-Aldrich公司,激活型半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,cleaved caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)抗体、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自北京索莱宝科技有限公司,二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;INC153型CO2细胞培养箱购自德国Memmert公司,3550UV型酶标仪、Mini-PROTEAN3型电泳槽、CheniDoc XRS化学发光成像分析系统购自美国Bio-Rad公司,CyFlow Counter型流式细胞仪购自德国Partec公司,TE22型转膜仪购自美国Hoefer公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与分组耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞培养于含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基,于37℃、含体积分数5%CO2的饱和湿度细胞培养箱中进行培养,培养至对数生长期时,以2.5 g·L-1胰蛋白酶消化制备细胞悬液,调整细胞浓度至5×107L-1后接种于6孔板,细胞融合度达75%时随机分为空白对照组、藏红花素组、顺铂组及联合组。空白对照组细胞用正常培养基培养,藏红花素组细胞用含终质量浓度400 mg·L-1藏红花素的培养基培养[7],顺铂组细胞用含终质量浓度5 mg·L-1顺铂的培养基培养[8],联合组细胞用含终质量浓度400 mg·L-1藏红花素和5 mg·L-1顺铂的培养基培养,继续培养48 h后行各指标检测。

1.3.2 CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率药物干预48 h后,取各组对数生长期细胞,经胰蛋白酶消化和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤后接种于96孔板,每孔1×104个细胞,加入CCK-8溶液10μL,继续培养4 h后使用酶标仪测450 nm处吸光度值,并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(空白对照组吸光度值-实验组吸光度值)/空白对照组吸光度值×100%。每组细胞设10个复孔,取均值。

1.3.3 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况取药物干预48 h后各组对数生长期细胞,经PBS洗涤后接种于6孔板,每孔5×105个细胞,每孔加入5μL FITC和5μL PI染液后轻轻混匀,4℃避光孵育10 min后使用流式细胞仪检测细胞凋亡状况并计算凋亡率(流式细胞图的左下象限为正常细胞、左上象限为坏死细胞、右上象限为晚期凋亡细胞、右下象限为早期凋亡细胞,细胞凋亡率为右上象限和右下象限的百分率之和)。每组细胞设10个复孔,取均值。

1.3.4 流式细胞术检测各组细胞周期分布情况取药物干预48 h后各组对数生长期细胞,经PBS洗涤后接种于直径60 mm培养皿,每皿5×106个细胞,加入3 mL体积分数75%乙醇溶液,于-20℃下固定1 h,1 500 r·min-1离心10 min(离心半径15 cm)取细胞,PBS冲洗2次后加入10μL RNA水解酶Rnase,37℃放置1 h,加入PI染液避光孵育0.5 h,使用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.3.5 Western blot法检测各组细胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、cyclin D1、CDK2蛋白表达取药物干预48 h后各组对数生长期细胞,PBS洗涤后超声破碎细胞,4℃12 000 r·min-1离心20 min后取沉淀,采用二辛可宁酸法进行蛋白质定量,水浴高温变性,然后应用Western blot法进行蛋白表达检测:通过电泳槽行凝胶电泳,通过转膜槽将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜,丽春红染色,质量分数5%脱脂奶粉封闭1 h,滴加稀释的兔抗人一抗cleaved caspase-3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、cyclin D1(1∶1 000)、CDK2(1∶1 000)后4℃孵育12 h,PBS洗膜后滴加稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶3 000),室温孵育1 h,DAB显色后应用Image J软件分析条带灰度值。以待测蛋白条带灰度值与β-肌动蛋白(β-actin)内参条带灰度值的比值表示蛋白相对表达量。实验重复10次,取均值。

1.4 统计学处理应用SPSS 13.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著性差异法t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组细胞增殖抑制率比较空白对照组、藏红花素组、顺铂组、联合组Hela/DDP细胞增殖抑制率分别为(0.00±0.00)%、(31.12±3.99)%、(34.96±4.30)%、(39.85±5.47)%。藏红花素组、顺铂组、联合组细胞增殖抑制率均高于空白对照组,差异有统计学意义(t=24.664、25.710、23.038,P<0.01)。藏红花素组细胞增殖抑制率与顺铂组比较差异无统计学意义(t=2.070,P>0.05);联合组细胞增殖抑制率高于顺铂组和藏红花素组,差异有统计学意义(t=2.222、4.077,P<0.05)。

2.2 4组细胞凋亡率比较结果见图1。空白对照组、藏红花素组、顺铂组、联合组细胞凋亡率分别为(5.12±0.79)%、(19.28±2.46)%、(20.63±2.68)%、(33.92±3.89)%。藏红花素组、顺铂组、联合组细胞凋亡率均高于空白对照组,差异有统计学意义(t=15.984、17.554、22.944,P<0.01)。藏红花素组与顺铂组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(t=2.043,P>0.05)。联合组细胞凋亡率高于顺铂组和藏红花素组,差异有统计学意义(t=8.897、10.059,P<0.01)。

图1 4组耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞凋亡情况Fig.1 Apoptosis of cisplatin-resistant human cervical cancer Hela/DDP cells in the four groups

2.3 4组细胞周期分布比较结果见表1。与空白对照组比较,藏红花素组、顺铂组、联合组G0/G1期细胞比例显著升高,G2/M期细胞比例显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。藏红花素组与顺铂组G0/G1、G2/M期细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。与藏红花素组和顺铂组比较,联合组G0/G1期细胞比例显著升高,G2/M期细胞比例显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组、藏红花素组、顺铂组、联合组S期细胞比例比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 4组耐顺铂人宫颈癌细胞Hela/DDP细胞周期分布比较Tab.1 Comparison of cell cycle distribution of cisplatinresistant human cervical cancer Hela/DDP cells among the four groups(±s)

表1 4组耐顺铂人宫颈癌细胞Hela/DDP细胞周期分布比较Tab.1 Comparison of cell cycle distribution of cisplatinresistant human cervical cancer Hela/DDP cells among the four groups(±s)

注:与空白对照组比较a P<0.01;与藏红花素组比较b P<0.05;与顺铂组比较c P<0.05。

组别n G0/G1期/%S期/%G2/M期/%空白对照组10 22.02±3.58 33.79±3.69 44.19±5.34藏红花素组10 36.40±4.17a 34.62±3.76 28.98±4.22a顺铂组10 39.35±4.23a 36.32±3.98 24.33±4.62a联合组10 44.01±4.70abc 37.76±4.43 18.23±4.88ab F 51.243 2.567 53.779 P 0.000 0.071 0.000 c

2.4 4组细胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2值比较结果见表2和图2。藏红花素组、顺铂组、联合组细胞中cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2值均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。藏红花素组细胞中cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2值与顺铂组比较差异无统计学意义(P>0.05)。联合组细胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量和Bax/Bcl-2值高于顺铂组和藏红花素组,差异有统计学意义(P<0.05);联合组细胞中Bcl-2蛋白相对表达量高于藏红花素组,差异有统计学意义(P<0.05);联合组细胞中Bcl-2蛋白相对表达量与顺铂组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 4组耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2值比较Tab.2 Comparison of relative expression of cleaved caspase-3,Bcl-2,Bax protein and the ratio of Bax/Bcl-2 in cisplatinresistant human cervical cancer Hela/DDP cells among the four groups(±s)

表2 4组耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2值比较Tab.2 Comparison of relative expression of cleaved caspase-3,Bcl-2,Bax protein and the ratio of Bax/Bcl-2 in cisplatinresistant human cervical cancer Hela/DDP cells among the four groups(±s)

注:与空白对照组比较a P<0.05;与藏红花素组比较b P<0.05;与顺铂组比较c P<0.05。

组别n cleaved caspase-3 Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2空白对照组10 0.09±0.03 0.19±0.04 0.26±0.06 0.73±0.14藏红花素组10 0.24±0.06a 0.34±0.07a 0.32±0.06a 1.11±0.23a顺铂组10 0.28±0.07a 0.41±0.10a 0.35±0.08a 1.19±0.30a联合组10 0.36±0.09abc 0.74±0.16abc 0.41±0.11ab 1.79±0.38abc F 29.314 42.053 6.070 25.072 P 0.000 0.000 0.002 0.000

图2 4组耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达Fig.2 Expression of cleaved caspase-3,Bcl-2,Bax protein of cisplatin-resistant human cervical cancer Hela/DDP cells in the four groups

2.5 4组耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞中cyclin D1、CDK2蛋白相对表达量比较结果见表3和图3。与空白对照组比较,藏红花素组、顺铂组、联合组Hela/DDP细胞中cyclin D1、CDK2蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。顺铂组细胞中cyclin D1蛋白相对表达量显著低于藏红花素组,差异有统计学意义(P<0.01);藏红花素组细胞中CDK2蛋白相对表达量与顺铂组比较差异无统计学意义(P>0.05)。联合组细胞中cyclin D1、CDK2蛋白相对表达量显著低于藏红花素组和顺铂组,差异均有统计学意义(P<0.01)。

表3 4组耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞中cyclin D1、CDK2蛋白相对表达量比较Tab.3 Comparison of relative expression of cyclin D1,CDK2 protein in cisplatin-resistant human cervical cancer Hela/DDP cells among the four groups(±s)

表3 4组耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞中cyclin D1、CDK2蛋白相对表达量比较Tab.3 Comparison of relative expression of cyclin D1,CDK2 protein in cisplatin-resistant human cervical cancer Hela/DDP cells among the four groups(±s)

注:与空白对照组比较a P<0.01;与藏红花素组比较b P<0.01;与顺铂组比较c P<0.01。

组别n cyclin D1 CDK2空白对照组10 0.95±0.21 0.51±0.12藏红花素组10 0.65±0.14a 0.35±0.09a顺铂组10 0.43±0.07ab 0.32±0.07a联合组10 0.28±0.06abc 0.14±0.04abc F 46.958 31.724 P 0.000 0.000

图3 4组耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞中cyclin D1、CDK2蛋白表达Fig.3 Expression of cyclin D1,CDK2 protein in cisplatinresistant human cervical cancer Hela/DDP cells in the four groups

3 讨论

目前,临床上治疗宫颈癌主要采取手术结合放射治疗、化学治疗的综合方案,该方案能够明显改善患者生活质量并延长生存期,早期未出现转移病灶的患者5 a生存率可达80%[9];ⅡB、ⅢA、ⅢB期患者5 a生存率分别为58%、35%、32%,Ⅳ期患者5 a生存率仅为16%[10]。我国每年约3万例患者死于宫颈癌[11]。顺铂被认为是治疗宫颈癌最有效的单药化学治疗药物[12],但获得性耐药严重制约了其临床应用,因此,寻找能够逆转顺铂耐药的药物对宫颈癌的治疗至关重要。

藏红花素是传统中药藏红花的主要活性成分,随着药理学研究的深入,其抗肿瘤活性得到关注。研究发现,藏红花素能够通过阻滞细胞周期进程、诱导细胞凋亡对人肺腺癌A549细胞、人胃癌BGC-823细胞[6]的顺铂耐药性起到逆转作用。本研究结果显示,与顺铂单独用药比较,藏红花素与顺铂联合给药能够更加显著地提高耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞的增殖抑制率和凋亡率、阻滞细胞周期于G0/G1期,提示藏红花素具有逆转人宫颈癌Hela/DDP细胞对顺铂耐药性的作用。

诱导细胞凋亡是顺铂抗肿瘤最主要的作用机制之一[13],该过程有多种基因、蛋白参与调控,cleaved caspase-3参与细胞凋亡的启动和执行,是细胞凋亡过程中最关键的调控蛋白[14]。Bcl-2家族基因对细胞凋亡线粒体通路信号传导发挥着关键作用[15],其中Bax能够促进细胞色素C释放、激活caspase-3而促进细胞凋亡,Bcl-2能够抑制Ca2+内流超载、保护线粒体膜通透性、抑制cleaved caspase-3活性,进而抑制细胞凋亡[16];Bcl-2和Bax能够形成异源二聚体而抑制细胞凋亡,Bax蛋白之间则能够形成同源二聚体而促进凋亡[17],因此,Bax/Bcl-2比值更能反映二者对细胞凋亡的调控作用。本研究结果显示,与顺铂单独用药比较,藏红花素与顺铂联合给药能够显著提高耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量,降低Bcl-2蛋白相对表达量,并提高Bax/Bcl-2值;与空白对照组比较,藏红花素单药干预能够显著提高Hela/DPR细胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量,降低Bcl-2蛋白相对表达量并提高Bax/Bcl-2值,这可能是藏红花素逆转人宫颈癌Hela/DDP细胞顺铂耐药性的重要分子机制。

抑制细胞增殖是顺铂抗肿瘤另一重要机制,而细胞增殖依赖正常的细胞周期运转。细胞周期过程由多种基因参与调控,其中cyclin D1和CDK2发挥着重要调控作用,二者均具有促使细胞周期通过G0/G1期限制点进入S期的作用[18]。本研究结果显示,与顺铂单独用药比较,藏红花素与顺铂联合给药能够显著降低耐顺铂人宫颈癌Hela/DDP细胞中cyclin D1、CDK2蛋白相对表达量;与空白对照组比较,藏红花素单独用药能够显著降低Hela/DPR细胞中cyclin D1、CDK2蛋白相对表达量,这可能是藏红花素抑制Hela/DDP细胞增殖的重要机制,也是逆转人宫颈癌Hela细胞顺铂耐药性的另一重要分子机制。

综上所述,藏红花素能够逆转人宫颈癌细胞对顺铂的耐药性,其机制可能与调节凋亡相关蛋白表达,进而促进Hela/DDP细胞凋亡、阻滞Hela/DDP细胞周期进程有关。

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