赵学亮，刘海金，王兴龙，萧 飒，党如意，杨增岐

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

MicroRNAs(miRNAs) 是一类长度为19～24 nt的内源性非编码小分子单链RNA，广泛存在于真核生物中，通过与靶基因mRNA的3′UTR区或5′UTR特异性结合，降解或抑制mRNA的翻译，进而在转录后水平调控基因表达[1]。LEE等[2]在1993年利用定位克隆法从秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中首次发现可阶段性调控胚胎后期发育的小分子RNA lin-4。随后REINHART等[3]在2000年发现具有调控线虫发育的基因let-7，这是第2个调控时序性发育的小分子，也是一个负调控因子。此后，国内外学者于2001年同时报道了在人、线虫和果蝇中鉴定到近百个小RNA分子，并统一正式命名为microRNA(miRNA)[4-6]，至此，开启了miRNA研究新的里程碑。截至目前，Sanger miRBase(http://www.mirbase.org/ Release 22.1，October 2018)数据库中收录的miRNA数目已达到38 589条，包括动物、植物和病毒在内的271个物种[7]，其中病毒的miRNA数量：320条前体miRNA和530条成熟体miRNA。每1条miRNA都可以靶向调控多个mRNA，同样，一个靶基因也可同时被多个miRNA调控。据报道，在真核生物中有60%～70%编码基因受miRNA的调控[8]，并广泛参与细胞增殖、分化、发育、代谢和凋亡等多种生理活动。

近年来研究发现，miRNA的调控作用几乎贯穿真核生物整个生命活动，并可通过直接作用于病毒，间接调控先天免疫、细胞凋亡及干扰素等途径参与抗病毒感染[9-10]。在病毒与宿主共进化的过程中，发现病毒基因组也可以编码miRNA，并在病毒-宿主相互作用中发挥关键作用[11]。因此，鉴定宿主来源/病毒来源关键miRNA，探究其在病毒感染、复制和抗病毒过程中发挥的作用，可为病毒致病机制的深入研究提供思路。现将系统梳理近年来参与调控病毒miRNA的研究进展，重点关注miRNA调控病毒逃避宿主天然免疫应答，为研究miRNA调控病毒与宿主相互作用提供参考和依据。

1 miRNA的生物合成

miRNA的生物合成比较复杂，首先miRNA在细胞核转录生成primary miRNA(pri-miRNA)，然后被RNA酶Ⅲ Drosha-DGCR复合体切割成60～70 nt的3′末端具有核苷酸突出、5′末端具有磷酸基的茎环中间体，即precursor miRNA(pre-miRNA)。随后，转运蛋白Exportin-5识别pre-miRNA的3′端并与之结合，通过Ran-GTP途径出核运输至细胞质。最后，Dicer酶(双链RNA专一性内切酶)识别pre-miRNA双链的3′及5′末端信号，将其剪切成约22 nt的成熟双链miRNA。最初，单独的miRNA没有功能且易降解，miRNA只有与Ago蛋白、双链RNA结合蛋白和Dicer核糖核酸内切酶等结合形成RNA诱导基因沉默复合物RISC(RNA-induced silencing complex，RISC)才能发挥功能[12]。通常，miRNA作用机制有2种，即靶向转录抑制和降解，前者主要存在于动物中，后者则多见于植物中[13]。miRNA种子序列(seed sequence)在RISC的介导下与其靶基因mRNA 3′UTR区结合，从而发挥负调控靶基因的作用[14]。近年来研究还发现，miRNA除结合mRNA的3′UTR区之外，还可以结合5′UTR、启动子或编码区发挥功能。

此外，miRNA的表达具有严格的组织特异性和时空性，人们把在肌肉中特异性表达的miRNA命名为myomiRs家族，包括miR-1、miR-133a和miR-206等，这些基因仅在心肌和骨骼肌中表达[15]。在线虫中，miR-35～miR-41基因家族仅存在Caenorhabditiselegans胚胎和幼虫期，在其他发育阶段未发现[6]；而miR-209～miR-295只在小鼠胚胎期表达[16]。总之，在真核生物不同发育阶段miRNA有其特定的表达模式。随着新一代测序技术(next generation sequencing，NGS)的发展，miRNA也越来越多的被发现，在病毒感染方面，对miRNA关注的焦点逐渐转向作用机制研究。据报道，宿主和部分病毒均可编码miRNA，病毒感染细胞后，宿主miRNA可以直接与病毒基因组相互作用抑制病毒复制[17]，在病毒和宿主共进化的过程中，病毒编码的miRNA通过直接与宿主mRNA结合，影响宿主翻译效率，抑制免疫应答，参与逃避宿主抗病毒免疫应答，促进病毒复制[18]。

2 宿主源miRNA的功能

在病毒感染过程中，宿主细胞编码的miRNA表达模式发生很大变化，同时这些差异表达的miRNA可通过调节先天性免疫、调控细胞凋亡和干扰病毒复制因子等途径进一步调节宿主基因的表达以抵抗病毒感染，此外，miRNA还可以作为病毒性疾病诊断和预后的生物标志[19]。目前，虽然病毒感染过程中宿主源miRNA表达调控机制尚未完全清晰，但可以肯定的是宿主源miRNA与病毒感染密切相关[20]。

2.1 miRNA调控宿主先天免疫先天免疫应答是在生物进化过程中宿主受到病毒入侵时，为保护自身稳定而形成的免疫系统。当病毒在宿主细胞复制时，天然免疫细胞会识别病原靶分子，即病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)。宿主细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别病原体PAMPs来抵抗病毒感染[21]。研究发现，miRNA在复杂的免疫系统中发挥着重要作用，并可通过JAK/STAT、NF-κB和Wnt等信号通路诱导干扰素和炎性细胞因子的产生来调节宿主免疫应答水平。DUAN等[22]研究发现，gga-miR-27b-3p通过靶向调控SOCS3/SOCS6增强IFN-1表达，提高STATs基因转录水平以及STAT1在701位酪氨酸的磷酸化水平，抑制传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)复制。在宿主适应能力与免疫选择压力的双重作用下，病毒形成了一套完整的拮抗干扰素通路的策略，使得病毒有效的在机体内复制。例如，在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、仙台病毒(Sendai virus，SeV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)中过表达内源性miR-1225-3p可通过IFN/JAK/STAT信号通路抑制IFN产生，从而促进病毒感染。干扰miR-1225-3p后，则使其靶基因GAB3过表达，增强干扰素应答和病毒触发的先天性免疫激活抵抗病毒感染[23]。H5N1感染A549细胞后，miR-324-5p的表达下调，机制研究发现，miR-324-5p通过JAK1-STAT3途径靶向负调控子CUEDC2诱导ISGs表达，IFN-I和IFN-Ⅲ的大量表达进而抑制H5N1复制[24]。此外，miR-30可通过IFN/JAK/STAT通路靶向抑制SOCS1/SOCS3表达，来抑制流感病毒(avian influenza virus，AIV)感染[25]。WU等[26]通过H5N1 AIV感染A549细胞后，miRNA136上调表达并促进RIG-I介导的天然免疫活化，抵抗病毒感染。CHEN等[27]通过对NDV感染的DF-1细胞进行深度测序，发现gga-miR-451和gga-miR-199-5p促进了NDV复制，而gga-miR-19b-3p和gga-miR-29a-3p抑制了NDV复制。进一步的功能研究表明，gga-miR-19b-3p可靶向RNF11和ZMYND11激活NF-κB信号转导，促进炎性细胞因子产生来抑制NDV复制[28]。在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)感染的宿主中发现miR-221-5p以剂量依赖性方式抑制病毒复制，干扰内源性miR-221-5p会增强病毒复制。过表达miR-221-5p后可通过激活NF-κB信号传导，在病毒感染期间上调IFN-β的表达来抑制PEDV[29]。在感染登革热病毒(Dengue virus，DENV)、西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)和寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)等黄病毒家族的宿主中，miR-34可抑制Wnt/β-catenin信号传导的能力而抵抗病毒感染，并证实miR-34增强了IRF3的磷酸化，诱导宿主细胞释放IFN-I。并发现Wnt和IFN信号通路之间的交叉点发生在糖原合酶激酶3β(GSK3β)-TANK结合激酶1(TBK1)结合点，诱导IRF3磷酸化并启动下游IFN信号传导，从而抵抗黄病毒感染[30]。

2.2 miRNA调控病毒复制及染毒细胞凋亡病毒感染宿主后，染毒细胞通过凋亡影响病毒复制过程。然而，这种凋亡方式是抑制病毒复制还是促进病毒复制，至今还有一定的争议。据报道，TAKAHASHI等[31]在感染SeV的细胞中发现LGP2表达量增加900倍，LGP2与miR-106b竞争结合TRBP，上调4种关键凋亡基因Caspases-2、Caspases-8、Caspases-3和Caspases-7来影响病毒复制。IBDV感染DF-1细胞后，gga-miR-16-5p通过靶向Bcl-2活化Caspases-9和Caspases-3触发凋亡机制，促进病毒复制[32]。miRNA通过细胞凋亡影响病毒复制多见于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染，miR-122通过下调/上调靶基因cyc-lin G(1)的表达来响应HBV感染，调节细胞凋亡，干扰p53对病毒的抑制，促进HBV的复制[33]。miR-340-5p直接与编码激活转录因子7(ATF7)的mRNA结合，通过与热休克蛋白A成员1B(HSPA1B)相互作用来促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，影响HBV复制[34]。miR-325-3p通过直接降低AQP5的表达来抑制Huh7-1.3和HepG2.2.15细胞的增殖并诱导其凋亡，发挥抗HBV的作用[35]。miR-211-5p可与lncRNA F11-AS1结合负调控NR1I3的表达，过表达miR-211-5p后抑制HepG2.2.15细胞凋亡，促进HBV复制增殖[36]。ZHANG等[37]利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染猪子宫内膜上皮细胞，鉴定出54个差异表达的miRNA，其中有2个miRNA通过p53途径参与了细胞凋亡机制。在感染马立克病病毒(Marek's disease virus，MDV)的鸡淋巴瘤细胞中，gga-miR-155可通过靶向RORA基因抑制细胞凋亡，促进病毒复制增殖[38]。WANG等[39]通过构建AIV感染A549细胞模型，发现miR-34a能与Bax基因3′UTR区结合，在病毒感染过程中抑制细胞凋亡，影响子代病毒复制，发挥抗病毒作用。另外，AIV感染能够诱导宿主细胞miRNA-29c表达，干扰Bcl-2家族抗凋亡蛋白表达，进而促进AIV诱导细胞凋亡进程[40]。

2.3 miRNA干扰病毒复制因子一般而言，宿主miRNA不直接靶向结合病毒基因，而是通过作用于病毒受体等病毒复制所需的因子，通过调控基因表达间接干扰病毒复制。例如，DEF细胞衍生的外泌体miR-148a-5p通过负调控TLR3表达来促进鸭坦布苏病毒复制[41]。在NDV中，gga-miR-455-5p通过靶向SOCS3抑制病毒复制，同样miR-375可与靶基因ELAVL4结合抑制病毒复制[42-43]。miR-218可调节山羊外周血单个核细胞中的信号淋巴细胞活化分子(SLAM)介导小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)感染[44]。miR-c89通过靶向宿主类视黄醇X受体β基因抑制PRRSV的复制[45]。宿主miR-1307促进VP3降解，增强先天免疫应答来抑制口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)复制[46]。在人类疾病中，miR802通过调节肝癌细胞中SMARCE1的表达诱导HBV的复制和免疫逃逸等[47]。miR-130a通过依赖ATG5的自噬途径靶向ATG5来调节宿主的抗病毒应答和HCV复制[48]。宿主miR340作为一种关键的抗病毒分子，在甲型流感和其他RNA病毒感染后，miR340下调表达，负调控RIG-I和OAS2表达，从而介导抗病毒应答[49]。

有趣的是，细胞编码的miRNA也可能促进病毒复制，例如，EV71诱导的miR-124通过直接靶向IL-6R和STAT3来抑制IL-6R和STAT3的表达，并显著降低宿主抗病毒免疫应答[50]。单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)感染细胞后，miR-373表达上调，通过特异性靶向IRF1 mRNA抑制干扰素调节因子表达，从而导致IFN-I和ISGs的下游降低，抑制先天免疫应答，最终促进HSV-1复制[51]。

3 病毒源miRNA

3.1 编码miRNA的病毒种类除宿主细胞可以编码miRNA外，部分病毒也可编码miRNA来促进病毒复制，抑制宿主基因表达，创造有利于病毒的微环境逃避宿主免疫应答。2004年，PFEFFER等[52]首次发现爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)基因组能够编码miRNA，其加工过程与真核生物相同，目前已发现EBV共编码25个miRNA，表达44种成熟miRNA[53-56]。随后，越来越多的病毒被证实能够编码miRNA。比如，HBV[57]、HSV-1[58]、MDV[59]、家蚕核型多角体病毒(bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)[60]、埃博拉病毒(Ebola virus disease virus，EBOV)[61]、AIV[62]、传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus，ILTV)[63]、鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)[64]、牛疱疹病毒5型(bovine herpesvirus 5，BoHV-5)[65]、人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)[66]等(表1)。由于HIV-1丰度低，生物学特性未知以及不同实验室报道结果不一，HIV可编码miRNA这一结论并没有被广泛接受。尽管miRNA在调控病毒与宿主相互作用机制方面取得了相当大的进展，但目前对病毒编码miRNA的鉴定还存在一定困难，尤其在动物病毒中，其产生的过程还需要进一步明确，其详细功能和作用机制仍需深入研究。据报道，目前仅有数十种病毒编码数百个miRNA，通过与宿主靶mRNA结合，调控病毒复制过程、生命周期来逃避宿主天然免疫应答。

表1 病毒编码miRNA的靶点及功能

3.2 病毒miRNA对宿主的调控

3.2.1调控宿主信号通路 EBV miR-BHRF1-2-5p直接靶向IL-1受体1(IL1R1)并阻断IL-1β，从而激活NF-κB通路[67]。白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)编码的miRNA(WSSV-miR-22)可以通过靶向宿主STAT基因来促进WSSV感染，并通过JAK/STAT-TEP1/TEP2信号通路介导病毒感染的免疫反应[68]。MDV1-miR-M4-5p可靶向结合LTBP1蛋白，负调控TGF-β信号通路的活化，从而促进c-Myc的表达，诱导肿瘤发生[69]。病毒编码的miRNA还可通过JAK-STAT信号通路及细胞因子促进病毒复制，进而逃避宿主天然免疫应答[70]。

3.2.2调控抗病毒免疫应答 自然杀伤细胞(natural killer cell，NK cell)与细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)对染毒细胞的杀伤是宿主对病毒防御的重要模式。EBV miR-BART2-5p可靶向抑制MICB在宿主细胞中的表达，通过抑制宿主NK细胞激活，从而逃避免疫识别[55]。猴病毒40(simian virus 40，SV40)编码的miRNA可靶向作用病毒编码的T抗原，干扰CTL对染毒细胞的敏感性，利用SV miRNA逃避宿主免疫系统[71]。人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)编码的miRNA(HCMV miR-UL112-3p)可以抑制内源性Toll样受体2(toll-like receptor2，TLR2)的表达，调控NF-κB通路，使病毒感染细胞逃过免疫监视[72]。

3.2.3调控细胞自噬与凋亡 在机体固有免疫中，宿主诱导染毒细胞凋亡是宿主阻止病毒扩散的一种方式。但病毒编码的miRNA会调控细胞周期，降低促凋亡蛋白表达，抑制细胞凋亡。在EBV感染中，EBV miRNA可调控宿主凋亡蛋白表达以抗细胞凋亡，如低水平的潜伏膜蛋白1(latent memgrane protein1，LMP1)可通过影响NF-κB信号通路，抑制p53诱导的凋亡[73]。BmCPV-miR-1通过上调BmIAP基因表达抑制细胞凋亡，为病毒复制提供更好的环境[74]。

4 小结与展望

目前，在病毒与宿主相互作用方面，miRNA已被认为是发挥关键作用的调控因子，近年来，随着生命科学研究的发展，越来越多新的宿主和病毒编码miRNA被发现，但由于miRNA靶基因的多样性及其在不同细胞和生物学过程中发挥不同作用，因此，在免疫应答及其调控过程中的机制较为复杂。目前，对于miRNA的研究只是冰山一角，仍然有大量未知序列及其生理功能等很多空白有待进一步探索。例如，目前对miRNA的研究多依赖于芯片及测序技术，对未知基因组序列的生物较少报道。如何突破现有方法和技术瓶颈，是揭开miRNA之谜的关键。miRNA的翻译及特异性miRNA组合对宿主免疫反应调节影响的研究是一个重大挑战。病毒感染导致宿主miRNA差异表达的机制以及miRNA如何通过ceRNA网络介导病毒与宿主之间的联系。目前有关miRNA的研究多在学术界，仅有少量的商品化miRNA产品，如何更好地把理论研究和临床应用相结合，仍有待深入探索。此外，miRNA作为传染性疾病的早期诊断标识物和治疗靶点也将是miRNA应用的一个新思路。相信随着科学研究的不断深入，miRNA调控病毒与宿主相互作用中所存在的盲区终将清晰，未来将可能在病毒相关疾病的防制方面带来新的突破。