韩 超，耿玉萌，李淑颖，史万玉，翟向和

(河北农业大学 中兽医学院，河北 保定 071001)

随着氟苯尼考(florfenicol,FFC)在畜禽养殖中被大量使用,其毒副作用越来越引起关注。首先，FFC的耐药性日益严重，例如：人兽共患的流感嗜血杆菌[1]、金黄杆菌[2]等对FFC多重耐药的菌株不断出现[3-4]。其次，FFC对动物组织器官的损伤作用也不断被报道,如抑制巨噬细胞吞噬[5]、淋巴细胞增殖[6]以及免疫反应[7]和造血功能[8]，进而导致疾病多发。此外，FFC滥用还可引起动物肝肾损伤[9]，致使其在体内的分解和排泄降低，导致FFC在动物源性食品中超量残留[10-11]，给公共卫生安全造成了严重威胁。

目前，在肉鸡养殖实践中，FFC常常从1日龄就在肉鸡饲料或饮水中低剂量添加，以对抗肠道细菌感染，进而提高雏鸡的成活率和生长速度[12]。但在这一过程中，FFC还常被超量使用，因此FFC对肉鸡的毒副作用不可避免[8]。近年来正常治疗剂量FFC的毒副作用也被广泛报道，可引起中度骨髓细胞发育不良[8]，并能促进鸡肝细胞的凋亡[13]。本实验室前期研究也发现:1日龄开始给予FFC能显著抑制雏鸡早期的增重，损伤雏鸡的造血功能，同时对雏鸡的肝脏功能造成损伤[14]。但FFC早期给药后，对肉雏鸡中后期的生长发育及肝脏功能是否还有明显影响尚不明确，故本试验对此进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料1日龄罗斯308肉鸡购自河北大午公司；FFC溶液购自山东德州神牛药业有限公司；谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)等生化试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；CYP1A1和CYP2H1 ELISA试剂盒购自上海恒远生物技术有限公司;总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒等购自北京普洛麦格生物技术有限公司。

1.2 实验动物分组与处理120只1日龄的罗斯308肉鸡被随机分成6组，每组20只，分别为A组：雏鸡从1日龄开始正常饮水和饲喂饲料；B～F组:从1日龄开始分别在饮用水中添加0.15(兽药典推荐剂量)，0.30，0.60，1.20，1.80 g/L的FFC连用5 d。各组正常饲喂饲料，分别于21，42日龄，试验鸡翅下静脉采血，并处死采取雏鸡的肝脏备用。

1.3 指标测定

1.3.1测定增重和肝脏指数 各组1日龄雏鸡记录初始体质量，饲喂到21和42日龄后再次对各组肉鸡测体质量，然后计算二者差值作为各组雏鸡的体质量增加量；并在各组随机选取10只肉鸡处死，摘取其肝脏测质量计算肝脏指数，肝脏指数=肝脏质量(g)/体质量(g)×100%。

1.3.2鸡全血中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(RGB)和血小板(PLT)的含量测定 采取各组42日龄鸡血液置于抗凝管，将血液与抗凝剂充分混合，利用全自动血液细胞计数仪检测全血中WBC、RBC、RGB和PLT的含量。

1.3.3鸡血清中ALT、AST、TP和ALB的含量检测 采取各组21，42日龄鸡血液置于促凝管，将其以倾斜放置于4℃、1 h，然后低速离心分离得到血清。利用分光光度计测定D值，并计算各组雏鸡血清中ALT、AST、TP和ALB的含量。

1.3.4检测鸡血清中MDA、CAT、GSH的含量 分离21，42日龄鸡血清并制作10%的肝脏组织匀浆后，利用半自动生化分析仪分别检测雏鸡血清中和肝组织匀浆中MDA、CAT、GSH的含量。具体参照文献[15]方法进行。

1.3.5RT-qPCR检测肝组织内mRNA的转录水平 使用总RNA提取试剂盒(Promega，Beijing，China)从肝脏中提取RNA，逆转录得到cDNA。通过实时定量荧光PCR方法检测肝脏中CYP1A1、CYP2H1、Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA转录水平。引物由TaKaRa(大连，中国)设计合成(表1)。预变性处理为95℃ 120 s，扩增进行45个循环，包括95℃ 5 s，64℃ 30 s，最后72℃ 30 s。内参基因为β-actin，由2-ΔΔCt法计算每个基因的相对转录水平。

表1 引物信息

2 结果

2.1 不同剂量的FFC对肉鸡增重的影响由表2可见，与空白组相比，21日龄时，0.15 g/L的FFC能引起雏鸡增重显著下降(P<0.05)，而其他剂量组的FFC能引起雏鸡体质量极显著下降(P<0.01)。42日龄时，0.15和0.30 g/L的FFC能引起雏鸡增重显著下降(P<0.05)，而其他剂量组的FFC能引起雏鸡体质量极显著下降(P<0.01)。

表2 各组雏鸡平均增重 g

2.2 不同剂量的FFC对肉鸡肝脏指数的影响与空白组相比，21日龄时，1.20 g/L的FFC能引起肉鸡肝脏指数显著升高(P<0.05)，而其他剂量组的肝脏指数没有显著性差异(P>0.05)。而42日龄时，1.20，1.80 g/L的FFC均能显著提高肉鸡肝脏指数(P<0.05)(表3)。

表3 各组肉鸡的肝脏指数

2.3 不同剂量的FFC对鸡全血中WBC、RBC、RGB和PLT含量的影响由表4可见，与空白组相比，仅1.20，1.80 g/L 的FFC能显著降低肉鸡血液中WBC的数量(P<0.05),而各剂量组的FFC均会导致全血中WBC的数量显著降低(P<0.05)，各组鸡全血中RGB的含量却无显著性差异(P>0.05)。另外，42日龄时，仅1.80 g/L的FFC仍会显著降低肉鸡全血中PLT的数量(P<0.05)。

表4 全血中各成分的计数

2.4 不同剂量的FFC对鸡血清中ALT和AST含量的影响如图1 所示，与空白组相比，各剂量组的FFC在21日龄时均能显著增加雏鸡血清中AST和ALT的含量(P<0.05),各组雏鸡血清中AST和ALT的含量到42日龄时却无显著性差异(P>0.05)。

图1 各组雏鸡血清中ALT(A)和AST(B)的含量

2.5 不同剂量的FFC对鸡血清中TP和ALB含量的影响如图2所示，FFC各处理组的鸡血清中TP的含量在21日龄时显著低于空白对照组(P<0.05),而42日龄时，与空白组相比，0.60,1.20,1.80 g/L 剂量的FFC仍会显著降低鸡血清中TP和ALB的含量(P<0.05)。

图2 各组雏鸡血清中TP(A)和ALB(B)的含量

2.6 不同剂量的FFC对鸡血清GSH、MDA、CAT含量的影响如图3所示，在21日龄时，与空白组相比，各剂量组的FFC均能显著增加鸡血清中MDA的含量(P<0.05)。同时测定肝组织中GSH和CAT含量发现，与空白组相比较，只有0.60，1.20，1.80 g/L剂量的FFC能显著减低肉鸡血清中GSH和CAT的含量；在42日龄时，与空白对照组相比，仅1.20，1.80 g/L剂量的FFC能显著增加肉鸡血清中MDA的含量(P<0.05)，显著降低肉鸡血清中 GSH和CAT的含量(P<0.05)。

图3 各组雏鸡血清和肝组织中GSH、MDA和CAT的含量

2.7 不同剂量的 FFC对鸡肝组织中肝药酶CYP1A1和CYP2H1 mRNA转录水平的影响如图4所示，检测CYP1A1和CYP2H1的mRNA转录水平发现：在21日龄时，与空白组相比，各FFC剂量组的雏鸡肝组织内CYP1A1和CYP2H1 mRNA 的转录水平均显著下降(P<0.05)；42日龄时，只有0.60,1.20,1.80 g/L剂量组肉鸡肝组织CYP1A1 mRNA 的转录水平显著低于空白组(P<0.05);而CYP2H1 mRNA 的转录水平各组之间均无显著性差异(P>0.05)。

图4 各组肉鸡肝组织中CYP1A1(A)和CYP2H1(B)mRNA转录水平

2.8 不同剂量的FFC对鸡肝组织中Nrf2通路蛋白mRNA转录水平的影响Nrf2蛋白通路是调节机体氧化应激的重要途径，如图5所示，在21日龄时，与空白对照组相比，0.15,1.20,1.80 g/L FFC能显著降低肝脏中Nrf2 mRNA的转录水平(P<0.05);0.60，1.20，1.80 g/L FFC能显著降低肝脏中HO-1 mRNA的转录水平(P<0.05 );1.20，1.80 g/L FFC能显著降低肝脏中NQO-1 mRNA的转录水平(P<0.05)。而到42日龄时，各个FFC剂量组雏鸡肝脏内Nrf2蛋白表达与空白组相比无显著性差异(P>0.05)。与空白组相比，1.20，1.80 g/L FFC能显著降低肝脏中HO-1 mRNA的转录(P<0.05)，而仅1.80 g/L 的FFC组与空白组相比较能显著减少鸡肝脏组织中NQO-1 mRNA转录水平(P<0.05)。

图5 各组雏鸡肝组织中Nrf2(A)，HO-1(B)和NQO-1(C)的mRNA转录水平

3 讨论

FFC作为氯霉素的替代产品，具有氯霉素类抗生素类似的功效，但副作用却较小，故成为畜禽疾病防治的常用药物[16]。但是，FFC在动物养殖中已应用多年，FFC(包括正常治疗剂量)的耐药性及毒副作用也被广泛报道。

HAN等[14]前期研究发现，正常推荐治疗剂量(0.15 g/L)的FFC对7日龄以内肉鸡的生长性能、造血功能以及肝脏的功能均有一定的损伤作用。本试验结果显示，在5日龄用药结束后的21和42日龄时，正常推荐治疗剂量(0.15 g/L)及更大剂量FFC仍显著抑制肉鸡的增重，降低RBC数量(P<0.05)；说明FFC作为“开口药”早期应用后，对肉鸡的生长性能和造血功能的损伤是持续存在的。

ALT和AST是肝脏细胞胞内酶，血清中含量上升就意味着肝脏细胞完整性受损，因此血清AST和ALT的含量是评价肝脏损伤的重要指标[17]。本试验研究发现，与空白组相比，不同剂量的FFC在21日龄时均能显著增加雏鸡血清中AST和ALT的含量(P<0.05)；各组雏鸡血清中AST和ALT的含量到42日龄时与空白对照组间均无显著性差异(P>0.05)；肝脏是血清中TP和ALB合成场所，血清中TP和ALB的含量能反映肝脏的功能。本试验结果显示，FFC各剂量组鸡血清中TP和ALB的含量在21日龄时均显著低于空白组(P<0.05),而到了42日龄时，0.60，1.20，1.80 g/L剂量的FFC仍会显著降低鸡血清中TP和ALB的含量(P<0.05)。由此可知，早期给予推荐剂量的FFC在肉鸡生长到21日龄时对肝脏仍有损伤作用，到了42日龄时这种损伤基本得以修复，而超剂量的FFC对肝脏的损伤一直持续到肉鸡出栏。

氧化应激是由细胞过度产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和亲电体引起的，而过量的ROS又可以诱导自由基链反应，破坏细胞生物大分子如蛋白质、脂质和DNA等，并诱发一系列生活习惯性疾病[18-19]。故肝脏内的氧化应激程度可以反映肝脏的功能状况[20]。本试验结果发现，在21，42日龄时，正常推荐剂量的FFC基本不会引起肝脏的氧化应激损伤，而一旦超过推荐剂量，就会对肝脏的氧化应激损伤很严重。机体为控制ROS水平并防止其积累，形成了一套复杂的抗氧化防御体系，其中核因子NF-E2相关因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是一种重要的氧化还原敏感性转录因子[21]，其通过诱导调控细胞内Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的组成型和诱导型表达，有利于改善机体氧化应激状态，促进细胞存活以及维持细胞的氧化还原稳态[22-23]。HAN等[14]的前期研究结果发现，7日龄内，推荐治疗剂量的FFC就能引起肉鸡肝脏组织内Nrf2 mRNA的转录显著下降；而本试验结果显示，21日龄时，只有超量的FFC才能引起肉鸡肝脏组织内Nrf2 mRNA的转录显著下降，而42日龄时，FFC的剂量不超过1.80 g/L时均不会引起肝脏组织内Nrf2 mRNA的转录水平显著下降(P>0.05)。另外，NOQ-1和HO-1作为Nrf2-ARE通路上的下游蛋白，在机体内协同发挥抗氧化的作用,同时又受到Nrf2蛋白的调控[24-25]。理论上，NOQ-1和HO-1在机体发生氧化应激时表达会增加，进而减轻机体的氧化应激[26]。HAN等[14]的前期研究结果显示，7日龄内，推荐治疗剂量的FFC同样也能引起肉鸡肝脏组织内HO-1和NQO-1 mRNA的转录水平显著下降。本试验结果显示，21和42日龄时，只有远远超过推荐剂量的FFC才能显著抑制Nrf2、NQO-1和HO-1的mRNA转录水平表达。说明随着肉鸡日龄的增长，正常推荐剂量的FFC对肝脏的氧化损伤基本消失，其原因可能是其对肝脏组织中Nrf2通路上抗氧化蛋白Nrf2、HO-1和NQO-1的表达抑制减轻，恢复了肝脏抵抗氧化应激的能力，进而对肝脏的损伤减轻。

药物本身或代谢产物可直接损伤肝脏细胞，导致肉鸡肝脏损伤最常见的就是抗生素、黄曲霉毒素、重金属等，它们的代谢产物大多具有肝毒性[27]。药物在肝脏中需进行两步反应，即Ⅰ相和Ⅱ相反应。Ⅰ相反应:将药物进行水解、氧化、还原，产生代谢产物，主要的代谢酶是细胞色素 P450(CYP)、CYP1A1及 CYP2H1 等都是导致药物性肝损伤相关的关键性氧化酶[28]。因此，肝细胞内肝药酶的含量对肝脏的解毒能力有直接的关系。之前我们研究结果发现，即使推荐治疗剂量的FFC也会引起肉雏鸡(不超过7日龄)肝脏内CYP1A1和CYP2H1的含量会显著下降，并且呈剂量依赖性。说明FFC可能够通过抑制肝脏内肝药酶的活性，进而增加FFC在肉鸡体内的代谢时间，增加FFC在体内的残留。而21日龄时，各个剂量FFC依旧会抑制肝脏内CYP1A1和CYP2H1的含量及mRNA转录水平，到42日龄时，只有超过0.15 g/L的FFC会显著抑制肉鸡肝脏内CYP1A1和CYP2H1的含量及mRNA转录水平。由此可知，正常推荐剂量FFC对肝脏内肝药酶表达的影响随着肉鸡的生长而逐渐减弱，而一旦FFC的剂量超过正常推荐剂量，其对肝脏内肝药酶的表达有持续性抑制作用。