刘 昆，曹金山，刘 博，丁玉玲，裴 乐，毛 伟*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031)

哺乳动物子宫在产后或交配的过程中易受到细菌的感染而导致不孕症或慢性子宫内膜炎。细菌感染产后奶牛子宫时，约20%的奶牛患子宫内膜炎，严重影响奶牛的产奶量与再孕率[1-2]。临床上常用于治疗奶牛子宫内膜炎的方法主要通过抗生素治疗，但无法提高该类疾病的治愈率和患病奶牛的再孕率[3]。

哺乳动物子宫微环境稳态对胚胎的正常发育至关重要，同时该稳态的维持与子宫内膜疾病的发生及患病后的用药治疗效果直接相关[4-6]。据报导，前列腺素E2(PGE2)可通过调控结缔组织生长因子及具有血管再生作用的IL-8的表达，在人子宫内膜修复过程中发挥着重要作用[7]。PGE2由花生四烯酸经一系列酶的催化作用产生，催化产生的酶类物质，除磷脂酶外还包括环氧合酶-1(cyclooxygenase-1，COX-1)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)。有研究指出,在奶牛发生子宫内膜炎的过程中，COX-2的mRNA表达量显著高于健康奶牛[8];另外，PECCHI等[9]提出PGE2是前列腺素类化合物中与各种炎症性疾病关联最密切的一种前列腺素，这表明PGE2不仅可修复子宫内膜而且与子宫内膜炎的炎症过程相关，而且细菌感染很大程度上诱导了奶牛子宫内膜中PGE2的合成[10]。

常见的感染奶牛子宫内膜的细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌与一些厌氧型细菌[11]。在细菌性子宫内膜炎中，奶牛子宫内膜受到细菌感染后引起炎症反应，细菌及细菌毒素诱导上皮细胞和基质细胞产生促炎性细胞因子与趋化因子。同时，受损或死亡的细胞所释放的内源性分子通过激活免疫细胞，引起免疫应答，这一类内源性分子被称为损伤相关因子。高迁移率蛋白(high-mobility grope box protein 1，HMGB-1)与透明质酸(hyaluronidase，HA)可作为多种炎症过程中的损伤相关因子。HMGB-1是一种重要的细胞内调节因子，参与细胞内DNA的转录、重组、翻译和修饰[12]。HMGB-1的释放与坏死细胞相关，该过程可简要描述为坏死的细胞释放的染色质被递呈细胞上的膜受体识别后释放到细胞外[13],说明HMGB-1与组织损伤相关。透明质酸酶广泛分布于多种组织及细胞内，在发生炎症的过程中，透明质酸酶由聚合的大分子物质，分解为小分子物质，并且分解的小分子物质常与其他蛋白相结合，形成透明质酸酶结合蛋白(hyaluronidase binding protein,HABP)，其中，形成的透明质酸酶结合蛋白1(hyaluronidase binding protein-1,HABP-1)与炎症反应密切相关[14]。

本试验以体外培养的奶牛子宫内膜组织作为研究对象，经热灭活金黄色葡萄球菌刺激，与COX-2抑制剂共孵育，通过ELISA、q-PCR、Western blot、免疫荧光及病理切片观察，检测内源性PGE2在降低后，金黄色葡萄球菌所引起的奶牛子宫内膜组织损伤因子HMGB-1与HABP-1表达水平及其组织的损伤是否发生变化。旨在通过阐述PGE2对细菌所引起的奶牛子宫内膜组织损伤的调控作用，为临床中合理使用前列腺素类药物治疗细菌性子宫内膜炎而导致的不孕症，继而提高奶牛繁殖能力提供新的疾病防制学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料本试验使用的金黄色葡萄球菌为内蒙古地区奶牛子宫内膜炎临床分离株,由内蒙古农业大学药理实验室保存(鉴定证书编号：SYS110018)；Mueller-Hinton(M-H)肉汤培养基(OXOID，England);COX-2抑制剂NS-398、CAY10404(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI);DMEM/F-12培养基(Gibco，China);青链霉素(Gibco，China);两性霉素B(Generay,China);Western blot试验所用一抗HABP-1、HMGB-1(Abbexa,UK),二抗山羊抗兔IgG抗体(Abcam,USA);RNA提取试剂盒(Axygen Scientific,USA);PGE2ELISA检测试剂盒(Cayman,Ann Arbor,MI);反转录试剂Primer ScriptRTMaster Mix(TaKaRa,Japan);SYBR Green Master(Rox,Germany);引物由Invitrogen公司合成。

1.2 奶牛子宫内膜组织的体外培养方法参照文献[7]方法与内蒙古农业大学药理实验室建立的优化培养条件，培养方法：取健康奶牛子宫角，置于含5%青链霉素、2%两性霉素的PBS中，4℃处理30 min。在无菌的环境下纵向剪开奶牛子宫角，暴露子宫内膜后，将奶牛子宫内膜剪成条索状并置于含2%青链霉素、1%两性霉素的PBS中4℃处理20 min，并重复此步骤。将处理后的奶牛子宫内膜组织剪成直径约2 mm，厚度约1 mm的块状组织，放入到含2%青链霉素、5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中在37℃、5%CO2条件下进行培养，每24 h更换1次培养液。

1.3 金黄色葡萄球菌的培养与热灭活金黄色葡萄球菌的制备使用M-H培养基对金黄色葡萄球菌进行培养。根据细菌生长时培养基D600 nm值的不同，绘制金黄色葡萄球菌的生长曲线，以确定金黄色葡萄球菌达到生长对数期的时间。将达到生长对数期的金黄色葡萄球菌5 000 r/min离心5 min，弃掉上清液，使用无菌PBS重悬浮后置于85℃水浴中，处理30 min。

1.4 热灭活金黄色葡萄球菌体外刺激奶牛子宫内膜组织与抑制剂的处理方法培养奶牛子宫内膜组织后3 d，将含5%胎牛血清与青链霉素的DMEM/F12培养基，更换为DMEM/F12培养基，饥饿处理后8 h，再将培养基更换为仅含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基。在培养基中分别加入无菌PBS，1×108CFU/mL热灭活的金黄色葡萄球菌处理8 h。在培养基中加入浓度均为1×10-7MNS-398、CAY10404处理15 min后，加入1×108CFU/mL热灭活金黄色葡萄球菌，37℃、5%CO2条件下培养8 h后收集奶牛子宫内膜组织与培养基上清液。

1.5 奶牛子宫内膜组织RNA提取及反转录使用Axgeny RNA提取试剂盒提取不同处理组的奶牛子宫内膜组织中RNA(具体步骤见说明书)，并检测提取的RNA浓度。将所有RNA样品均稀释至终质量浓度为100 mg/L。使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，反转录体系：ddH2O 5 μL,cDNA 3 μL，5×Primer Mix 2 μL。反转录条件：37℃ 15 min,85℃ 5 s。

1.6 荧光定量PCR反应荧光定量PCR反应体系：SYBR GreenMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各0.75 μL，模板2.5 μL，总体积25 μL。反应条件：95℃ 10 min；95℃ 15 s,60℃ 30 s,40个循环。引物信息如表1所示。

表1 引物信息

1.7 Western blot检测研磨奶牛子宫内膜组织，置于1.5 mL离心管中，加入组织裂解液与磁珠后，在磁珠研磨机中裂解3 min，冰上静置5 min后，14 000 r/min 离心10 min，收集上清液，测定所提取蛋白的浓度，并与5×蛋白缓冲液进行混合。电泳：配制12% SDS-PAGE胶，每孔蛋白质量为20 μg。以80 V电压，恒压电泳至条带到胶的末端后停止电泳。切下蛋白大小为31,42,23 kDa附近的SDS-PAGE胶。转膜：按照正极—电转海绵—滤纸—PVDF膜—SDS-PAGE胶—滤纸—电转海绵—负极的顺序装配，调整转膜仪电压至25 V，转膜时间为90 min。封闭：取出PVDF膜放入到5%脱脂乳中室温孵育2 h。一抗孵育：按照β-actin 1∶3 000,HABP-1、HMGB-1为1∶1 000的比例进行稀释，与电转后的PVDF膜在4℃条件下过夜孵育。二抗孵育：取出PVDF膜，使用TBST润洗10 min，润洗3次后在室温环境下孵育二抗1 h。成像：使用TBST润洗 5 min，润洗4次后置于成像仪中，加入ECL显色液后，根据PVDF膜上的条带清晰程度调整曝光时间。

1.8 奶牛子宫内膜组织中PGE2ELISA试验收集体外培养的奶牛子宫内膜组织的上清液，以10 000 r/min 离心10 min后收集上清液，使用PBS稀释20倍，用以检测奶牛子宫内膜组织分泌到培养液中PGE2的含量。

1.9 HE染色将不同处理组的奶牛子宫内膜组织，置于梯度酒精中进行脱水处理(酒精浓度为：100%,95%,80%,75%,50%)，置于石蜡中包埋，并制作切片，使用苏木精、伊红染色液对石蜡切片进行染色，在光学显微镜下(40×)观察组织病理变化，拍照记录。

1.10 免疫荧光染色试验将奶牛子宫内膜组织制作成冰冻切片，经冷丙酮固定后，加入3%过氧化氢溶液处理5 min以去除非特异性结合。使用TBST润洗3次，每次10 min。封闭：将冰冻切片置于含5%牛血清白蛋白中室温封闭2 h；一抗孵育；将HABP-1与HMGB-1一抗按照1∶200进行稀释后与冰冻切片在4℃条件下过夜孵育;二抗孵育：取出冰冻切片，使用TBST润洗10 min，润洗3次后加入荧光二抗，置于暗盒中，室温孵育1 h；成像：TBST润洗5 min，润洗4次后，使用激光共聚焦显微镜成像。

2 结果

2.1 PGE2的分泌水平检测结果为验证热灭活金黄色葡萄球菌是否可诱导PGE2的蓄积，以及本试验所使用的COX-2抑制剂是否可降低由热灭活金黄色葡萄球菌所上调的PGE2的分泌量。在体外培养的奶牛子宫内膜组织培养液中分别加入PBS(control，空白对照组)、热灭活的金黄色葡萄球菌(HK-S.aureus)、热灭活金黄色葡萄球菌与COX-2抑制剂(CAY10404、NS-398)共孵育8 h后收集上清液，ELISA检测PGE2分泌量。结果如图1所示，加入热灭活金黄色葡萄球菌后，PGE2蓄积量显著高于空白对照组(P<0.05),而与CAY-10404与NS-398共孵育后，PGE2表达量较热灭活金黄色葡萄球菌处理组显著降低(P<0.05)，说明本试验使用的COX-2抑制剂可降低由热灭活金黄色葡萄球菌所上调的PGE2的分泌量，该浓度的抑制剂可用于后续试验。

2.2 HMGB-1、HABP-1 mRNA与蛋白的表达量检测结果本试验通过检测损伤相关因子HMGB-1、HABP-1的表达水平，以证明PGE2在体外是否可介导由金黄色葡萄球菌所引起的奶牛子宫内膜组织的损伤。HMGB-1、HABP-1 mRNA与蛋白表达水平如图2所示，仅加入COX-2抑制剂(CAY-10404与NS-398)时，HMGB-1与HABP-1 mRNA表达量与空白对照组无显著性差异(P>0.05)，说明该浓度下的抑制剂对培养的奶牛子宫内膜组织无影响，可用于后续的试验。加入热灭活金黄色葡萄球菌处理后，HMGB-1、HABP-1 mRNA与蛋白表达量与空白对照组比较显著上升(P<0.05)，而热灭活金黄色葡萄球菌与CAY-10404、NS-398共孵育后，HMGB-1(图2A,C)与HABP-1(图2B,D) mRNA与蛋白表达量与热灭活金黄色葡萄球菌处理组相比，显著下降(P<0.05)，说明PGE2在体外可介导由金黄色葡萄球菌所引起的奶牛子宫内膜组织的损伤。

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母标注表示差异不显著(P>0.05)。下同

图2 HMGB-1(A,C)和HABP-1(B,D)表达量

2.3 HMGB-1、HABP-1免疫荧光检测结果进一步检测HMGB-1、HABP-1的表达水平，使用免疫荧光的方法检测HMGB-1(图3A～D) 及HABP-1(图3E～H) 在奶牛子宫内膜组织中的荧光强度。检测结果显示，收集不同处理组的奶牛子宫内膜组织，分别加入PBS处理(图3A,E)、热灭活金黄色葡萄球菌(图3B,F)、热灭活金黄色葡萄球菌与CAY-10404(图3C,G)、热灭活金黄色葡萄球菌与NS-398(图3D,H)。结果显示:加入热灭活金黄色葡萄球菌后HMGB-1与HABP-1荧光强度上升(P<0.05)，而加入CAY-10404与NS-398及HMGB-1(图3I)与HABP-1(图3J)后荧光强度显著下降(P<0.05)。

图3 HMGB-1(A～D,I)与HABP-1(E～H,J)免疫荧光检测结果

2.4 HE染色结果为验证损伤相关因子的表达水平，是否与奶牛子宫内膜组织的损伤程度相一致。本试验使用HE染色方法，观察组织的实际损伤程度。不同处理组的奶牛子宫内膜组织HE如图4所示，对照组(图4A)奶牛子宫内膜组织腺上皮细胞完整，且完整排列于腺体周围，加入热灭活金黄色葡萄球菌后(图4B)，腺上皮细胞发生皱缩，而与CAY-10404(图4C)与NS-398(图4D)共孵育后，腺上皮细胞皱缩程度降低。

3 讨论

细菌性奶牛子宫内膜炎多发于产后1～4周奶牛，其发病机理及炎症过程中的调控过程尚不清楚[10,16-17]。PGE2是前列腺素类化合物中与炎症反应最密切的，在奶牛患子宫内膜炎时，COX-2与mPGES-1 mRNA的表达量均显著高于健康奶牛[7,10]，并且与一些促炎性细胞因子呈正相关关系，这提示PGE2参与奶牛子宫内膜炎。

本试验使用2种COX-2抑制剂：CAY10404和NS-398，结果显示COX-2抑制剂可显著降低损伤相关因子HMGB-1与HABP-1的mRNA和蛋白的表达量。HE染色结果显示，金黄色葡萄球菌损伤奶牛子宫内膜腺上皮细胞。研究表示，奶牛子宫内膜腺上皮细胞除分泌功能外，还充当着由胚体传递信号给母体的介质作用，这种作用与维持胚胎的稳定相关[16]。金黄色葡萄球菌可损伤腺上皮细胞，这可能与细菌性子宫内膜炎导致的产后不孕相关，金黄色葡萄球菌在奶牛子宫内膜炎中常被认为是亚临床型感染细菌，而不受到关注。本试验结果表明，金黄色葡萄球菌可引起较为严重的子宫腺上皮损伤，因此在治疗时，必须予以重视。COX-2抑制剂可显著抑制金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜腺体上皮细胞的损伤，并与损伤相关因子检测结果相一致，说明PGE2可调控奶牛子宫内膜组织中损伤相关因子的表达。

我国奶牛存栏量已达1 400余万头[16]，已成为我国养殖业的主要组成部分之一。在奶牛养殖生产工作中，造成奶牛淘汰的主要原因之一是生殖系统疾病。以内蒙古自治区为例，因奶牛生殖系统疾病所导致的延期受孕、不孕或治疗成本过高等而淘汰造成的经济损失每年约达10亿元，在兽医临床上虽然常用前列腺素类药物和非甾体类抗炎药治疗生殖系统疾病，但仅靠兽医工作者的经验用药，难以获得理想的用药效果，缺乏系统的理论指导和基础理论的支持。如何提高奶牛的生产性能和母牛的受胎率，显著提高牧场的经济效益，提高奶牛繁殖障碍疾病的治愈率是亟待解决的问题。同时，阐明生殖内分泌的关键活性物质的种类及其作用机制和生殖道疾病的发病机理，才能从根本上解决通过临床上有效提高奶牛繁殖能力的问题。本试验证明HABP-1与HMGB-1同样可作为奶牛子宫内膜炎的损伤相关因子，且受到PGE2的调控，表明PGE2调控细菌性子宫内膜组织的损伤，这对科学治疗奶牛生殖系统疾病和提高奶牛的繁殖能力具有现实意义。

总之，金黄色葡萄球菌可造成奶牛子宫内膜组织严重损伤，损伤相关因子HMGB-1，HABP-1与奶牛子宫内膜组织损伤程度呈正相关关系，PGE2可诱导金黄色葡萄球菌所造成的奶牛子宫内膜组织损伤。