汤璐瑶,黄子林,黄林玉,吕一品,唐 雪

(江南大学食品学院,食品营养与功能食品工程技术研究中心,江苏无锡 214122)

中华绒螯蟹(Chinese mitten crab),又称大闸蟹、河蟹或螃蟹,肉味鲜美,含有多种维生素、蟹红素、蟹黄素等,营养价值较高,是我国长江中下游地区最重要的养殖对象之一[1]。河蟹养殖中,通常会出现性早熟的一龄河蟹以及小规格的二龄河蟹,如果作为鲜活水产品销售,价格极低[2];若加工处理为香辣蟹等产品销售,则对河蟹鲜美风味破坏较为严重。针对这种小规格河蟹,通常采用整体蒸煮的加工方式,人工挑出蟹肉蟹黄,经过加热熬制,可获得具有河蟹鲜香风味的蟹肉蟹油半成品,可直接用于餐饮消费和菜肴增鲜提味[3]。然而由于蟹肉蟹油中蛋白质和脂肪含量较高,暴露在空气中极易被氧化腐败变质,导致其保质期不长,在运输过程中又极易氧化变质,严重限制了产品的生产和销售规模。

表1 熟制蟹肉蟹黄感官评分表Table 1 Sensory scoring scale for cooked crab meat and crab roe

气调保鲜技术是一种通过调节气体的组成来延长食品的储存寿命和保质期的技术,广泛用于生鲜、熟肉制品、水果和水产的保鲜[4]。影响保鲜效果的主要因素为塑料包装的气体阻隔性,包装前食品的卫生指标,贮藏气体的配气比例和贮藏温度四个方面[5]。目前针对水产品的气调保鲜的研究大多以鱼虾为研究对象。熟制蟹肉蟹黄营养成分与鱼虾类似,但脂肪与蛋白质含量相对更高,故在理论上可以利用气调保鲜的方法延长其货架期,为其运输和销售提供便利。因此,本实验通过比较检测分析空气和不同气体成分包装方式对熟制蟹肉蟹黄菌落总数、pH、代谢产物、感官品质的影响、挥发性风味物及呈味核苷酸等方面,分析风味物质变化规律并预测货架期限,最后确定产品最佳气调包装方式。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小规格的成熟河蟹(体重约150～200 g) 市售;生理盐水 安徽双鹤药业;标准固体培养基、无水乙醇、硫酸(纯度:98%) 上海百灵威科技;硝酸、甲基橙、亚甲基蓝、氧化镁、盐酸、氢氧化钠、硼酸 国药集团上海试验化学试剂有限公司;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)测定试剂盒 南京建成生物研究所。

SW-CJ-1F净化工作台 苏州净化设备有限公司;GHP-9270隔水式恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;FA-C电子天平 上海精科天平仪器厂;5804R冷冻高速离心机 德国eppendorf公司;SCIONSQ-456-GC气相色谱质谱仪 美国BRUKER公司;K1301自动凯氏定氮仪 上海晟声自动化分析仪器有限公司;Titrette数字瓶口滴定器 德国BRAND公司;ST310手持匀浆器 德国IKA公司;PH610 pH计 WIGGENS公司;Epoch 微孔板分光光度计 美国Bio-tek仪器有限公司;HH-3A恒温水浴锅 常州国华仪器有限公司;KM100-3M气体混合及配量系统 德国WITT公司;GI54T高压蒸汽灭菌锅 美国ZEALWAY公司。

1.2 实验方法

1.2.1 河蟹的处理 小规格的成熟河蟹(体重约150～200 g),整只蒸煮30 min,人工挑出蟹肉蟹黄,加热熬制至翻滚冒泡(约10 min),冷却后制得熟制蟹肉蟹黄样品。

将样品用尼龙/聚乙烯塑料袋包装,每袋100 g。先抽真空,后分别充入空气、60% CO2+40% N2和40% CO2+60% N2密封,检测包装袋气密性,放入恒温培养箱于4 ℃下保藏以便进行后续测定。

1.2.2 菌落总数及pH测定 菌落总数参照国家相关标准进行测定;运用GB 4789.2-2016规定的平板菌落计数法,对不同气体结构保鲜下的同种产品进行不同周期采样测定。pH测定方法:取10 g熟制蟹肉蟹黄匀浆与50 mL去离子水混合均匀后用pH计进行测定。

1.2.3 丙二醛(MDA)测定 丙二醛测定:参照南京建成生物工程研究所出品的丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法)说明书进行测定操作。

1.2.4 挥发性盐基氮(TVB-N)测定 挥发性盐基氮参照国家相关标准进行测定;运用GB 5009.228-2016规定的自动凯氏定氮法对不同气体结构保鲜下的同种产品进行不同周期采样测定。

1.2.5 感官评价 运用Just-About-Right(JAR)评分法对10名志愿者进行不同气调保鲜方案下的产品的感官评定和质量评定,确定消费者对不同气调保鲜方案下产品的喜好程度。

根据熟制蟹肉蟹黄的本身的风味及特点对其色泽、气味和质地分别设置了分级,并随机了邀请10位志愿者对不同温度和气体环境下的熟制蟹肉蟹黄进行感官评定,评分标准如表1所示。

1.2.6 挥发性风味物质测定 在顶空瓶中放入2.50 g熟制蟹肉蟹黄,插入老化后的75 μm Car/PDMS萃取头,并在60 ℃下吸附30 min,SCION SQ-456-GC(BRUKER US)上进样,解吸至平衡后,GC-MC进样。

色谱条件:DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱,氦气为载气,程序升温,流速0.9 mL/min;进样口温度为250 ℃;不分流式进样。

质谱条件:EI离子源;发射电流80 μA;检测电压1000 V;电子能量70 eV;离子源温度200 ℃;传输线温度250 ℃。

1.2.7 呈味核苷酸测定 取5.00 g熟制蟹肉蟹黄放置于离心管中,加入30 mL 5%高氯酸溶液,匀浆两次;将匀浆器用同浓度高氯酸洗涤两次,将洗涤液合并到离心管中,4 ℃下在1000 r/min离心10 min,取出上清液;用相同浓度的高氯酸洗涤沉淀物,离心后合并上清液;用0.5 mol/L NaOH将合并的上清液调节pH至6.5,用超纯水将体积调节至1000 μL;经0.25 μm滤膜过滤后,取10 μL在Agilent-1260 HPLC仪上进样分析。

HPLC主要技术参数:色谱柱:Diamonsil-C18(5 μm,4.6×250 mm),紫外检测器(260 nm);流动相:A:0.05% H3PO4,B:95%甲醇;进样量:10 μL;流速:1.0 mL/min;柱温为30 ℃。

1.3 数据处理

使用Excel和SPSS v19.0软件对实验数据进行统计学分析,显著性方差分析法采用单因素方差分析(One-way ANOVA)DUNCAN检验,检测限为0.05。结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示。用Graphpad prism 8完成图形绘制工作。

2 结果与分析

2.1 不同气调包装对熟制蟹肉蟹黄菌落总数的影响

菌落总数是衡量产品货架期长度的重要依据之一,产品货架期不仅与产品的化学组分有关[6-7],也与不同的包装方式和贮藏温度相关。如图1所示,在4 ℃贮藏条件,空气对照组菌落总数随贮藏时间延长增长最快,显著高于其他处理组(P<0.05)。60% CO2+40% N2组和40% CO2+60% N2组的菌落总数,在第4、10、20 d分别达到3.23、4.10、4.81 lg CFU/g和3.11、4.02、4.58 lg CFU/g。研究发现,CO2可通过延长细菌生长阶段中的延滞期和传代时间来抑制细菌活性,降低细菌生长繁殖速度,且二氧化碳浓度在30%～40%具有较好的抑菌效果[8]。熟制蟹肉蟹黄属于弱碱性食品,一般水产品中的优势菌群如假单胞菌、无色杆菌和食品致病菌等的最适生长pH一般为中性偏酸性[9]。充入较高浓度的二氧化碳不但会使包装塌陷[10],而且还会降低pH,促进腐败菌生长,使菌落总数随贮藏时间延长上升较快,这可能是40% CO2+60% N2组抑菌效果优于60% CO2+40% N2组的原因之一。这与吕飞等[11]研究醉虾的气调包装结果一致。根据最新的国家标准和农业行业标准,参考虾类鲜度评判标准(105CFU/g)[12-14]可粗略得出,在4 ℃下空气保藏货架期则为18 d左右,60% CO2+40% N2包装约为25 d左右,40% CO2+60% N2包装为28 d左右。何耀辉等[15]研究也发现40% CO2+60% N2混合气体充气包装保鲜,在2～4 ℃条件下可保存草虾26 d。

图1 不同的包装方式对熟制蟹肉蟹黄中菌落总数的影响Fig.1 Effects of different packing methods on the total colony of cooked crab meat and crab roe

2.2 不同气调包装对熟制蟹肉蟹黄pH的影响

pH即氢离子浓度指数,是判断熟制蟹肉蟹黄质量的重要指标。由图2可知,在4 ℃条件下,随着贮藏时间延长各组pH均呈现先减小后增加的趋势,该结果与张建友[16]气调包装毛虾的pH变化规律类似。样品初始pH为8.09,偏碱性。在贮藏前期由于微生物含量较低,其生长活动不足以改变外环境pH,pH降低主要是因为样品中残余的内源酶分解脂肪生成游离脂肪酸和外源充入CO2溶解[17]。从第10 d开始,熟制蟹肉蟹黄的pH开始逐渐上升,这主要是由熟制蟹肉蟹黄中的微生物的代谢引起的,与Ozogul等[18]报道的水产品pH在贮藏期间逐渐增大的趋势类似。此外,在整个实验期间,60% CO2+40% N2组pH始终低于其它两个处理组,这可能与其较高浓度的CO2有关。不同比例的CO2和N2混合气体包装的虾制品,CO2比例越高,pH越低[16],这与本研究的结果一致。

图2 不同包装方式对熟制蟹肉蟹黄pH的影响Fig.2 Effectsof differentpacking methods on pH value of cooked crab meat and crab roe

2.3 不同气调包装对熟制蟹肉蟹黄丙二醛(MDA)的影响

丙二醛(MDA)是自由基氧化多不饱和脂肪酸降解得到的氧化终产物[19]。大量MDA可引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合,且具有一定的细胞毒性。MDA含量可在一定程度上反映组织细胞脂质过氧化的速率和程度[20-23]。不同气体成分在4 ℃下贮藏对熟制蟹肉蟹黄中MDA含量的影响如图3所示,贮藏1～12 d,各组MDA含量变化不大且无明显差异,这可能是由于低温抑制了微生物生长和内源酶活性,使不饱和脂肪酸氧化降解速度变慢,从而抑制了MDA的生成,达到了良好的抑制脂质氧化的效果[24-25]。第12～20 d,空气组随贮藏时间延长MDA含量增加最快,60% CO2+40% N2组MDA含量在各个时间点略高于40% CO2+60% N2组,可能是各组微生物含量的差异引起的脂质氧化速度不同,同时CO2浓度增加可能对于酶解反应有一定的促进作用,使 MDA含量增加[26]。对草鱼片的气调包装的研究也发现40% CO2气调包装组MDA值低于60%气调包装组[26]。

表2 熟制蟹肉蟹黄以TVB-N值为依据的货架期预测Table 2 Shelf life prediction of cooked crab meat and crab roe based on TVB-N value

国家对食用动物油脂也有明确的MDA含量标准,即不得大于2.5 mg/kg,这也为以脂质氧化程度为标准预测熟制蟹肉蟹黄货架期提供了明确的理论依据[27]。本研究结果显示,在整个实验周期中,熟制蟹肉蟹黄MDA含量均在国家标准允许的范围内。

图3 不同包装方式对熟制蟹肉蟹黄MDA含量的影响Fig.3 Effects of different packing methods on MDA content of cooked crab meat and crab roe

2.4 不同气调包装对熟制蟹肉蟹黄挥发性盐基氮(TVB-N)的影响

挥发性盐基氮(Total volatile base nitrogen,TVB-N)是肉制品及水产品鲜度的主要卫生评价指标[28]。甲壳类水产品的肌肉含有大量的可溶性氮和游离氨基酸,因此其腐败过程往往伴随着大量挥发性盐基氮的产生,可通过测定挥发性特征气味物质的多少,判断产品腐败程度或新鲜度[29]。根据国家标准,熟制蟹肉蟹黄中挥发性盐基氮含量在20 mg/100 g以下时符合二级鲜度,其中挥发性盐基氮含量超过30 mg/100 g时熟制蟹肉蟹黄即为变质[12]。

不同气体包装的熟制蟹肉蟹黄TVB-N值变化如图4所示。在贮藏温度4 ℃下,空气组TVB-N值增长速率最快,60% CO2+40% N2组和 40% CO2+60% N2组增长速率明显降低,但60% CO2+40% N2组值略高于40% CO2+60% N2组,可能是因为40% CO2+60% N2有效减缓了由微生物繁殖而造成的蛋白质分解,这与雷志方等人[30]的结论一致。此外,氮气作为完全惰性气体,可很好地预防食品油脂的氧化酸败、VC的氧化分解等不良反应,提高产品品质,降低 TVB-N 水平[31]。

图4 不同包装方式对熟制蟹肉蟹黄 挥发性盐基氮含量的影响Fig.4 Effects of different packing methods on volatile base nitrogen content of cooked crab meat and crab roe

2.5 以TVB-N值预测货架期

对不同气体成分的熟制蟹肉蟹黄在不同温度下贮藏得到的TVB-N值进行线性拟合,计算其回归方程并对其二级鲜度和变质时间点做出预测。结果如表2所示。

表2中的回归方程中,贮藏天数为自变量x,熟制蟹肉蟹黄的TVB-N值为因变量y。回归方程系数(regression coefficient)是指回归方程中表示自变量x对因变量y影响大小的参数。回归系数越大表示x对y的影响越大[32]。研究表明,4 ℃下,40% CO2+60% N2气调包装将熟制对虾的货架期由7 d延长至21 d[26]。在本研究中,不论是以二级鲜度还是以变质时间确定货架期,在4 ℃下,以40% CO2+60% N2为贮藏气体货架期均最长,结合菌落总数估算货架期长短的结果,最后货架期限约为28 d。

2.6 感官评定结果分析

感官评定结果如表3所示,其中甲组为第0 d熟制蟹肉蟹黄,即未贮藏的新鲜样品;乙组为参考TVB-N值得出的刚达到二级鲜度标准时的样品;丙组则为实验周期内未变质的最后一天的熟制蟹肉蟹黄。

表3 熟制蟹肉蟹黄感官评定结果Table 3 Sensory evaluation of cooked crab meat and crab roe

表4 不同天数4 ℃下贮藏熟制蟹肉蟹黄挥发性物质组成及相对含量Table 4 Relative content and composition of volatile compounds in cooked crab meat and crab roe stored at 4 ℃ for different days

由表3所示,乙组和丙组熟制蟹肉蟹黄在40% CO2+60% N2组的气体贮藏下都与同组的其他样品有较显著的差异(P<0.05),且得分较高,证明感官质量良好。这可能是因为相对于同为气调保鲜组的40% CO2+60% N2组,60% CO2+40% N2组的CO2浓度过高,被熟制蟹肉蟹黄吸收导致肉质发酸引起感官不适从而导致得分较低[33]。而空气对照组得分最低的结果也证明了适当CO2浓度的气调保鲜对熟制蟹肉蟹黄感官性质的保持起积极作用。由此也可以判断三组不同气体对感官性质保持起较好作用的是40%CO2+60%N2的混合气体组。

2.7 不同气调包装对熟制蟹肉蟹黄挥发性风味物质的影响

挥发性风味物质是影响整体风味的重要因素,也是评价水产品质量的一个重要指标,也决定了消费者的接受度[34]。为探究最适熟制蟹肉蟹黄在贮藏条件下风味的变化情况,采集4 ℃,40% CO2+60% N2组熟制蟹肉蟹黄在包装前(0 d)、接近二级鲜度(第14 d)和接近变质(第20 d)时间点的样品,运用气相色谱法对其挥发性风味物质进行了检测。由表4可知,包装前样本供检测到醇类11种、酮类6种、醛类14种、烃类25种、芳香类6种、酯类5种以及其他7种,其中酯类、烃类和醛类含量分别占到了41.70%、34.60%和20.10%,为主要挥发性风味物质。随着贮藏时间的延长(第14～20 d),烃类和醛类显著降低(P<0.05),分别到占18.10%和1.59%,而醇类、酮类有显著提高(P<0.05),酯类则无显著性变化。

图5 挥发性化合物种类数Fig.5 Number of volatile compounds

一般研究认为熟肉特征性风味的主要来源是脂肪的氧化,氧化让脂肪酸降解产生氢过氧化物,进一步降解产生醇、酮、醛、碳氢类物质[35]。由图5可知,熟制蟹肉蟹黄在气调贮藏下其主要挥发性风味物质种类依然随着时间的延长而逐渐减少。未贮藏时检测得挥发性风味物质种类为74种,贮藏第14和20 d时其挥发性风味物质种类分别为66种和57种,表明挥发性风味物质种类和含量与贮藏时间长短呈负相关。未贮藏熟制蟹肉蟹黄中的烃类物质含量显著高于贮藏14 d和20 d的样品(P<0.05),但研究表明碳氢类化合物并不影响样品的风味特征。不饱和脂肪酸氧化降解的主要产物多为醛类物质,其具有奶油、脂肪、草香以及清香等气味[36],醛类化合物随贮藏时间的延长逐渐减少符合熟制蟹肉蟹黄随时间延长风味受损的趋势。除醛类化合物外,酯类也是熟制蟹肉蟹黄风味的重要组成成分,酯类大多具有花香、果香或蜜香香气,然而三组间酯类化合物含量没有显著性差异(P>0.05)。因此,40% CO2+60% N2气调包装熟制蟹肉蟹黄,挥发性风味物质种类随时间延长逐渐减少,主要表现为醛类化合物和芳香类化合物含量减少,醇类化合物和酮类化合物增加,酯类化合物基本保持不变,这可能是维持蟹肉蟹黄风味品质的重要原因。

2.8 不同气调包装对熟制蟹肉蟹黄呈味核苷酸的影响

Yamaguchi等的研究结果发现,呈鲜味核苷酸共有30多种,其中以5′-鸟苷酸和5′-肌苷酸为代表[37]。由表5可知,4 ℃贮藏条件下40% CO2+60% N2组第14 d腺嘌呤核苷酸(AMP)含量(49.46%)显著低于第0 d样品的61.89%(P<0.05),而IMP、HxR和HX的含量则显著高于第0 d样品(P<0.05),这可能与AMP的分解途径相关。AMP代谢逐次生成IMP、HxR和HX。相关研究表明AMP和IMP是中华绒螯蟹中主要的核苷酸类物质[38],然而熟制蟹肉蟹黄中的IMP含量明显偏低,这可能是与熟制蟹肉蟹黄加工过程中经过了一次熬煮有关,IMP的热稳定性较差,在受热过程容易降解,加热后HxR和HX的增加也都和IMP的降解有关。

表5 核苷酸类化合物含量比较Table 5 Comparisonof nucleotide compounds content between optimum group and unsortedsamples at secondary freshness in controlled atmosphere storage

从呈味的角度来看,第14 d的样品AMP含量显著降低(P<0.05),会影响熟制蟹肉蟹黄的鲜味,但IMP的含量显著增加(P<0.05),且IMP与谷氨酸有相乘的呈味效果[39],能一定程度上缓解第14 d样品的鲜味损失。此外,第14 d样品Hx和HxR含量显著增加会导致样品有一定苦味[40]。因此,经过4 ℃下气调包装熟制蟹肉蟹黄,其风味取决于谷氨酸含量,谷氨酸含量越高,鲜味流失越少,且经过一定贮藏时间后样品可能会产生一定苦味。

3 结论

本实验初步证实了在4 ℃时,三种不同气调包装方式(空气,60% CO2+40% N2和40%CO2+60% N2)中,40% CO2+60% N2的包装方式为产品最优气调包装方式。该气调包装可显著降低熟制蟹肉蟹黄贮藏期间菌落总数、挥发性盐基氮(TVB-N)和丙二醛(MDA)含量,可使熟制蟹肉蟹黄在4 ℃延长货架期至28 d左右。同时,挥发性风味物质种类和含量随时间延长而减少,但酯类含量基本不变;呈味核苷酸AMP显著降低,而IMP、HX和HxR含量显著提高,这使得熟制蟹肉蟹黄保持了一定的鲜味并伴随轻微苦味。