孙伟杰,雷 博,何 园,马淑梅,刘 楠,梅其炳,刘 莉,*

(1.西南医科大学药学院,四川泸州 646000; 2.中国医药工业研究总院药理评价研究中心,上海 200040)

近年来,食品安全事件频发,物理性、化学性、生物性危害层出不穷,其中病原微生物污染逐渐增多,它能引起多种食源性疾病,对人类可能会造成严重甚至是致命的影响[1-4]。因此,迫切需要寻找新型、有效、安全的抗菌药物。植物精油能以接触或熏蒸的方式在食物周围形成抑菌氛围而达到防腐保鲜的作用,此类精油是人类开发绿色抗氧化剂和抗菌防腐剂的重要原料[5-8]。樟树(Cinnamomumcamphora),又名香樟、乌樟、樟木、芳樟等,其盛产于我国沿海一带,广西、江西、福建、台湾、湖南、湖北、四川、云南等地均有,以台湾产量最大[9-12]。从樟树提取的樟树精油具有芳香气味和良好的防腐、消炎、抗病毒、杀菌、杀虫等活性,目前被应用于香料、医药和食品工业等生活领域[13-14]。白色念珠菌(Candidaalbicans)或称白色假丝酵母,其广泛存在于各种野生动物和家禽、家畜的肠道中,如牛、猪、鸡等,它可以通过动物携带者或患者粪便污染外环境,从而污染食物尤其是肉类食品引起传播,导致一些疾病[15-18]。

周海旭等[19]通过抑菌试验表明了樟叶精油对革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草杆菌)均具有不同程度的抑制作用,且后者比前者对樟叶精油耐抗性强。Wu等[20]发现樟树精油具有明显的气相抗菌活性,它诱导细菌细胞膜破裂,增加细菌细胞的通透性,增加细胞内物质的渗漏,改变蛋白质结构,从而影响细胞的正常生长和生理代谢。Chen等[21]发现樟树精油对MRSA、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、鸡沙门氏菌和大肠埃希菌具有良好的抗菌活性,且表明樟树精油通过破坏细胞膜和干扰氨基代谢,表现出抗MRSA活性。目前对樟树精油抗细菌的研究逐渐增多,但是对真菌的研究还较少,而且白色念珠菌的感染率近年来明显增高,且其安全性尚未可知,这决定了樟树精油能否得到进一步应用。

本文通过研究樟树精油及其单体抗白色念珠菌的活性及其安全性,为樟树精油抗真菌的开发利用和开发绿色安全、无污染的食品防腐剂提供理论参考,促进食品工业的进一步发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豚鼠 平均体重为(250±10) g左右的42只白色清洁级雌性豚鼠,小鼠 平均体重为(20.0±0.5) g左右的75只ICR雄性小鼠，购买于上海西普尔-必凯实验动物有限公司;饲料 南通特洛菲饲料科技有限公司;樟树精油、1,8-桉叶油素、桧烯、α-松油醇、3-蒈烯、松油烯-4-醇、α-松油烯、异松油烯、柠烯 四川宸煜林业开发有限责任公司;葡萄柚、柠檬、熏衣草精油 菓凯化妆品有限公司;MH琼脂培养基、MH肉汤 青岛高科园海博生物技术有限公司;白色念珠菌(ATCC 98001) 中国医学科学院皮肤病研究所真菌室;脱毛膏 利洁时家化有限公司。

370 Series CO2细胞培养箱 Thermo Fisher Scientific公司;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;全波长多功能酶标仪 Thermo Fisher Scientific公司;7890B气相色谱仪、5977B质谱检测器 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 取白色念珠菌菌种于MH肉汤活化24 h,然后再转移至MH琼脂培养基分离单个菌落,在超净台上,用移液枪吸取MH肉汤培养基3 mL,加入已经灭菌的试管中,然后再用接种环在MH琼脂培养基中挑取单个菌落,加到MH肉汤中,放入培养箱内培养,培养时间24 h,培养温度37 ℃。

1.2.2 抗菌活性的测定

1.2.2.1 纸片法 将菌悬液稀释到1×106CFU/mL,再将无菌棉签浸入该菌悬液中。在试管内壁液面上方旋转数次并紧压棉签,挤出多余的菌液。用棉签快速均匀地涂布在琼脂培养基表面,然后绕平板边缘涂抹一周,重复三次。将灭好菌的滤纸片放在待测液中浸泡1 min,充分吸收后,用无菌镊子取出纸片轻轻贴放于平板表面。将平皿置于37 ℃培养箱培养48 h后,观察并测量抑菌圈的直径。实验重复3次,取平均值。

1.2.2.2 微量肉汤稀释法 将菌悬液稀释到1×106CFU/mL,采用二倍稀释法用无菌生理盐水将待测物配制成不同的浓度(DMSO含量为0.05%),在96孔板上将不同浓度的待测物与等量MH肉汤混合,使营养肉汤含精油浓度为8～64 μL/L,同时设置空白对照组和只加菌液的模型组。每组设置3个平行实验孔。37 ℃培养48 h。观测结果:澄清透明的孔说明能够抑制可见菌生长的最低抑菌浓度即MIC。

1.2.3 樟树精油成分分析 利用气相色谱-质谱联用仪,对樟树精油进行挥发性成分检测。吸取10 μL精油,溶解在1 mL丙酮溶液,0.45 μm微孔过滤膜过滤,上机测定。GC-MS条件:色谱柱:HP-5毛细管色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm),进样口温度250 ℃,载气为高纯He,载气流量为1.0 mL/min;柱温:程序升温60～200 ℃,初始温度60 ℃保持1 min,再以14 ℃/min升至200 ℃,容积延迟3 min;进样量为1 μL,分流比1∶20。质谱接口温度250 ℃;电离方式为EI;电子能量70 eV;离子源温度:230 ℃;扫描范围20～550 m/z。各组分分别与标准谱库进行检索匹配,并结合文献报道进行定性分析。定量分析按峰面积归一化法计算各峰面积的相对含量。

1.2.4 樟树精油各组分的抑菌活性 参照1.2.2.1纸片法测定各组分对白色念珠菌的抑菌圈直径。

1.2.5 豚鼠皮肤刺激性实验 动物饲养于上海医药工业研究院实验动物房适应性喂养一周,实验期间动物自由饮水,摄食,温度:20～26 ℃,相对湿度30%～70%,人工照明12 h明暗交替,通风良好。参考杜建红等[22]将42只豚鼠分成14个组,每组3只,用脱毛膏给豚鼠背部两侧的用药区进行脱毛处理,分别吸取2%、4%的樟树精油及其单体200 μL,滴于豚鼠背部,每天涂抹一次,对照组滴水,连续7 d,每天观测豚鼠背部有无红斑。评分规则为无红斑可见为0分,红斑勉强可见为1分,中度红斑为2分,紫红色红斑并有焦痂形成为3分。

1.2.6 对小鼠皮肤毛细血管通透性的实验 动物饲养于上海医药工业研究院实验动物房适应性喂养一周,实验期间动物自由饮水,摄食,温度:20～26 ℃,相对湿度30%～70%,人工照明12 h明暗交替,通风良好。将ICR小鼠随机分为15组,每组5只。小鼠在给药前1 d,用脱毛膏将小鼠背部脱毛(2.5 cm×3 cm)。实验当天分别于脱毛处涂上2%、4%的樟树精油及其单体,每天1次,对照组涂水,连续7 d。末次给药1 h后每只小鼠在给药处皮内注射磷酸组胺0. 1 mL(0.1 μg),注射后立即由尾静脉注射0.25%伊文思蓝溶液(4 mL/kg),15 min 后脱臼处死。用角膜环钻取下蓝染部分的皮肤,剪碎后浸泡于丙酮-生理盐水(7∶3)溶液2 mL中,48 h后离心,取上清液,用 UV 260紫外分光光度计在波长610 nm处,以丙酮-生理盐水溶液空白校零,测定所取样本的吸光度(A)值。

1.3 统计学分析

2 结果与分析

2.1 樟树精油抗白色念珠菌的活性分析

采用纸片法和微量肉汤稀释法测定的樟树精油抗白色念珠菌活性与其他植物精油的比较结果见表1。纸片法结果显示樟树精油的抑菌圈为(10.78±1.48) mm,比葡萄柚、薰衣草、柠檬都要强,同纸片法结果一样,微量肉汤稀释法结果显示樟树精油的MIC最小,为(10.67±4.62) μL/L。以上结果表明樟树精油抗白色念珠菌活性高于葡萄柚、薰衣草、柠檬精油。

表1 樟树精油抗白色念珠菌活性与 其他植物精油比较Table 1 Comparision of the Cinnamomum camphora essential oil anti-Candida albicans activity with other plant essential

2.2 樟树精油化学成分分析

采用GC-MS对樟树精油的化学成分分析结果如图1和表2。图1是樟树精油的总离子流色谱图,从图中可以看出共显示出16个峰,各组分分别与标准谱库进行检索匹配,鉴定出其中14个化学成分,按峰面积归一化法计算各峰面积的相对含量,14个化学成分占樟树精油总相对含量的97.22%。其中1,8-桉叶油素含量最高,为48.02%,其次是桧烯、α-松油醇、3-蒈烯、松油烯-4-醇、α-松油烯、异松油烯、柠烯等。樟树精油根据主成分划分为五种化学类型,即芳樟型、脑樟型、桉樟型、龙樟型和异樟型[23]。芳樟型,主含77.4%的芳樟醇;脑樟型,主含75%的樟脑;桉樟型,主含41.53%的桉叶油素;龙樟型,主含74.42%的龙脑;异樟型,主含29.41%的异橙花叔醇。以上结果表明本试验所用的樟树精油属于桉樟型樟树精油,且化学含量大于2%的有8种,分别为1,8-桉叶油素、桧烯、α-松油醇、3-蒈烯、松油烯-4-醇、α-松油烯、异松油烯、柠烯。

图1 樟树精油的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of Cinnamomum camphora essential oil注:化合物编号与表2相对应。

表2 樟树精油的化学成分及其含量Table 2 Composition and content of Cinnamomum camphora

2.3 樟树精油单体抗白色念珠菌活性分析

通过纸片法测定的樟树精油单体(含量2%以上)抗白色念珠菌活性的结果见表3。其中活性最强的是α-松油醇,抑菌圈为(26.70±1.03) mm,其次是异松油烯、α-松油烯、松油烯-4-醇、桧烯、1,8-桉叶油素。而3-蒈烯、柠烯对白色念珠菌没有抑菌活性。1,8-桉叶油素具有解热镇痛、祛痰止咳、抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多方面的药理活性[24]。胡文杰等[25]发现1,8-桉叶油素能够使尖孢镰刀菌菌丝的生长、孢子的萌发发生较明显的变化。凌天冀等[26]研究了桉叶油对5种细菌的最低杀菌浓度,并对桉叶油与丹参、青霉素、链霉素、卡那霉素与金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌等的联合抗菌作用做了初步实验研究,证实桉叶油除有广泛的抗菌作用外,还是一种有效的抗菌增强剂。根据GC-MS所呈现出的化学成分含量,1,8-桉叶油素含量最高,但抗菌活性相对较弱,这可能是因为白色念珠菌是真菌,它的细胞壁不同于细菌细胞壁的组成成分[27],因此它的抑菌活性没有α-松油醇、异松油烯等强。桧烯含量为11.43%,α-松油醇含量为10.15%,但α-松油醇所产生的抑菌圈却是桧烯的2倍左右。异松油烯抑菌活性比α-松油烯、松油烯-4-醇、桧烯、1,8-桉叶油素活性要强,但含量却很低。以上结果表明樟树精油抗白色念珠菌的活性来源是α-松油醇、异松油烯、α-松油烯、松油烯-4-醇、桧烯、1,8-桉叶油素。

表3 樟树精油单体抗白色念珠菌活性Table 3 Anti-Candida albicans activity of Cinnamomum camphora essential oil

表4 樟树精油及其单体对豚鼠皮肤刺激性影响Table 4 Effects of Cinnamomum camphora essential oil and its composition on skin irritation of guinea

2.4 樟树精油及其单体对豚鼠皮肤刺激性影响

樟树精油及有抗白色念珠菌活性的单体(以上6种)进行豚鼠皮肤刺激性实验结果见表4。精油可以通过三种方式进入人体:皮肤系统、呼吸系统、消化系统。大多数纯精油不可直接和皮肤接触,须混合于基础油中使用,基础油一般采用冷压萃取的高质量植物油,常见的如荷荷巴油、甜杏仁油、玫瑰籽油。结果显示4%樟树精油在连续涂抹5 d后会出现轻微的红斑,4%松油烯-4-醇在涂抹2 d后会出现轻微的红斑。α-松油醇、异松油烯、α-松油烯、桧烯、1,8-桉叶油素对豚鼠皮肤皆没有刺激性。以上结果表明樟树和松油烯-4-醇可能会对皮肤产生损伤作用。

2.5 樟树精油及其单体对毛细血管通透性的影响

樟树精油及有抗白色念珠菌活性的单体(以上6种)对毛细血管通透性的影响结果见表5。与对照组比较,2%松油烯-4-醇组毛细血管通透性增加,但没有显著性差异,4%松油烯-4-醇组毛细血管通透性极显著增加(P<0.01)。2%和4%桧烯有增加毛细血管通透性的趋势,但没有明显差异,而α-松油醇、异松油烯、α-松油烯、1,8-桉叶油素对毛细血管通透性都没有影响。以上结果表明4%松油烯-4-醇会使皮肤毛细血管通透性增加。

表5 樟树精油及其单体 对毛细血管通透性影响Table 5 Effects of Cinnamomum camphora essential oil and its composition on vascular

3 结论

本研究对樟树精油及其单体抗白念菌的效果进行了测定,同时也比较了樟树精油和其他几种植物精油的抗菌效果,结果表明樟树精油的抗菌效果强于葡萄柚、柠檬、薰衣草精油。同时又通过质谱仪对樟树精油的成分进行了分析,根据分析结果,选择了含量较高的单体进行抗白念的抗菌实验,实验结果表明,多种单体对白念菌具备较好的抗菌效果,但其活性的主要来源还需进一步研究。最后也对樟树精油及其单体的安全性进行了动物实验模型的评价,结果表明樟树精油及其单体具有较好的生物安全性。结果对食品安全以及医药领域具有一定的指导意义。