路兴旺 刘博 陶小燕 窦全文

摘 要：披堿草属（Elymus L.）是禾本科（Poaceae）小麦族（Triticeae）中的一个多年生属，该属在青藏高原地区有广泛分布，多数物种是草原和草甸的组成成分，许多种类为品质优良的牧草。垂穗披碱草（E. nutans）和达乌力披碱草（E. dahuricus）同为禾本科小麦族披碱草属异源六倍体物种，染色体组组成皆为StYH。为探究垂穗披碱草遗传多样性形成的内在机制，该研究利用微卫星（SSR）分子标记，对采自青藏高原地区同域分布的垂穗披碱草和达乌力披碱草两个居群共58个个体进行遗传多样性和遗传结构分析。结果表明：8对引物在垂穗披碱草和达乌力披碱草扩增条带分别为163条和124条，多态性位点百分率（PPB）分别为89.71%和76.07%，多态性信息含量（PIC）分别介于0.583～0.929和0.524～0.830之间。垂穗披碱草遗传多样性（He=0.69，I=1.34，Pp=100%）高于达乌力披碱草（He=0.53，I=0.80，Pp=93.75%）;同域分布的垂穗披碱草和达乌力披碱草居群，垂穗披碱草呈现出更高的遗传多样性。AMOVA分子变异显示，两个物种居群内遗传变异分别80.92%和63.62%，但居群间遗传分化水平较低。遗传结构分析揭示两个物种间有基因流存在。综合分析结果认为，该地区种间杂交基因渗透引起的种内遗传分化，在这两个物种多样性形成中可能起着重要作用。

关键词： 垂穗披碱草， 达乌力披碱草， 遗传多样性， 遗传结构， SSR标记

中图分类号：Q948

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2021）03-0418-11

收稿日期：2019-11-15

基金项目：青海省重大科技项目（2018-NK-A2） [Supported by the Major Science and Technology Program of Qinghai Province （2018-NK-A2）]。

作者简介： 路兴旺（1990-），硕士研究生，主要从事牧草遗传多样性研究，（E-mail） 2268013394@qq.com。

通信作者：窦全文，博士，研究员，主要从事植物遗传资源研究，（E-mail） douqw@nwipb.cas.cn。

Genetic diversity and genetic structure in populations of sympatric Elymus nutans and E. dahuricus

LU Xingwang1，2， LIU Bo1，2， TAO Xiaoyan1，2， DOU Quanwen1，3*

（ 1. Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota， Northwest Institute of Plateau Biology， Chinese Academy of Sciences， Xining 810001，  China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 3. Key Laboratory of Crop Molecular Breeding of Qinghai Province， Northeast Institute of Plateau Biology， Chinese Academy of Sciences， Xining 810008， China ）

Abstract：Elymus L. is a perennial genus in the Triaceceae family of Poaceae， which is widely distributed in the Qinghai-Tibet Plateau. Most species are components of grasslands and meadows， and many species are good quality pastures. Both E. nutans and E. dahuricus belong to Triteceae family （Elymus L.）， which are heterologous hexaploidy， with StYH chromosome composition. In order to further explore the intrinsic mechanism of genetic diversity of E. nutans， we used SSR molecular markers to analyze genetic diversities and genetic structures of 58 individuals collected from two codomain populations of E. nutans and E. dahuricus in the Qinghai-Tibet Plateau. The results were as follows： There were 163 and 124 amplified bands in 8 pairs of primers in E. nutans and E. dahuricus， respectively. Percentages of polymorphic loci （PPB） were 89.71% and 76.07%， respectively， and the polymorphism information contents （PIC） were between 0.583-0.929 and 0.524-0.830， respectively. The genetic diversities of E. nutans （He=0.69， I=1.34， Pp=100%） were higher than those of E. dahuricus （He=0.53， I=0.80， Pp=93.75%）， and E. nutans showed higher genetic diversity. The AMOVA molecular variation showed that the genetic variations within the population of the two species were 80.92% and 63.62%， respectively， while the levels of genetic differentiation among populations were low. Genetic structure analysis revealed the presence of gene flow existed between the two species. It is concluded that intraspecific genetic differentiation caused by interspecific hybridization， and may play an important role in the diversity formation of these two species.

Key words： Elymus nutans， Elymus dahuricus， genetic diversity， genetic structure， SSR marker

垂穗披碱草（Elymus nutans）属禾本科（Poaceae）、小麦族（Triticeae）、披碱草属（Elymus L.）多年生物种，在青藏高原地区分布范围很广，从海拔1 000 m谷地至海拔5 000 m的高山均有分布（Lu，1993）。垂穗披碱草呈现广泛的生态适应性和极强的抗旱、抗寒性（Ren et al.，2010）。在高寒地区，垂穗披碱草生长旺盛，特别适合作为草场优质牧草，同时其草种被人工驯化后，被广泛应用于青藏高原生态草地的修复治理以及人工草地的建制（马玉寿等，2006;梁国玲等，2011）。达乌力披碱草（Elymus dahuricus）与垂穗披碱草同属披碱草属，都为异源六倍体物种（2n=42），在染色体组成上与垂穗披碱草相同，染色体组合为StStHHYY。达乌力披碱草作为优良牧草，广泛分布于中亚、俄罗斯、蒙古、中国、韩国、日本和印度北部（Baum et al.，2011;颜济和杨俊良，2013）。相对于垂穗披碱草，达乌力披碱草在青藏高原地区分布区域较小，局部区域与垂穗披碱草重叠分布。利用SSR和ISSR标记研究表明我国境内达乌力披碱草遗传多样性较高;青海高原东部及周边地区是我国达乌力披碱草发生分化的地理分界区域，且在该地区发现特殊的分化类型（李永祥，2005）。

青藏高原垂穗披碱草具有丰富的遗传变异特性，无论在形态学（张建波等，2009;德英等，2011;陈仕勇等，2016）、细胞学（Dou et al.，2009，2011）、生化标记（Miao et al.，2011）、分子标记（Chen et al.，2009;Yan et al.，2009;Chen et al.，2013;彭语洛等，2018）等方面，垂穗披碱草均呈现出丰富的遗传变异特性。而达乌力披碱草仅在遗传多样性研究评价方面有少量报道（李永祥等，2005）。前人研究认为地理环境因素在垂穗披碱草遗传多样形成中起着重要作用（严学兵等，2007;Chen et al.，2009），环境因素在长期自然选择过程中可以塑造不同生态型的多样性形成，但是物种内在的遗传多样性形成及维持机制对物种多样性形成起着决定作用，而关于这方面的研究鲜有报道。由于垂穗披碱草和达乌力披碱草染色体组成相似，且同域分布时两个物种所处外界环境相同，因此本研究通过比较分析两个同域分布物种的遗传多样性及遗传结构，旨在深入了解种间杂交基因渗透在青藏高原地区同域分布的垂穗披碱草和达乌力披碱草遗传多样性形成的内在机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料采自青藏高原青海湖地区同一区域，材料来源和编号如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 基因组总DNA提取 取垂穗披碱草和达乌力披碱草各20粒种子，单粒置于培养皿中，当种子萌发长出幼根时，移栽到瓦盆中，当其长出3～4片叶子时，采用改良CTAB法（Allen et al.，2006）提取基因組总DNA。提取的DNA浓度和质量用紫外分光光度计（Nanodrop2000c，Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）和1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 多态性引物筛选 选用53对老芒麦SSR引物（Lei et al.，2014）和37对EST-SSR引物（Zhou et al.，2016），以及对应的优化反应条件和体系，随机挑选5份垂穗披碱草和5份达乌力披碱草DNA进行PCR扩增。待扩增完成后，应用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选出扩增条带清晰、杂带少、扩增结果稳定的引物，待用。

1.2.3 SSR扩增和PAGE电泳 扩增体系和反应程序如下：反应总体积25 μL，其中含Takara公司的10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1的dNTP 2.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板（50 ng·μL-1）1 μL，rTaq酶0.3 μL，dd H2O补足25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，50 ℃/60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物采用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，300 V电压下电泳50 min，嗅化乙锭（EB）染色，并用BIO-RAD自动凝胶成像系统照相保存。

1.2.4 数据分析 SSR为共显性分子标记，依据PAGE电泳图读取基因型数据，参照夏寒冰等（2009）提出的分子标记基因型数据转换为二元矩阵方法，将得到的“0、1”二元矩阵数据导入NTSYS-pc软件。在NTSYS软件中基于Dice遗传相似系数（GS值），采用非加权平均法（UPGMA）作聚类分析;利用POPGENE1.32软件计算等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、期望杂合度（He）、观察杂合度（Ho）、香农多样性指数（I）、多态性位点百分率（Pp）和多态性信息含量指数（PIC）;利用ARLIQUIN 3.5对群体进行分子方差分析（AMOVA），计算居群间和居群内分化系数，并作比较。

2 结果与分析

2.1 SSR多态性引物筛选

本研究选出8对扩增条带清晰、多态性良好的引物（表2），对同域分布的垂穗披碱草和达乌力披碱草进行SSR电泳分析。

2.2 SSR多样性分析

在90对SSR引物中，筛选出8对扩增条带清晰且稳定的多态性引物，8对SSR引物在垂穗披碱草中扩增片段介于100～500 bp之间（图1）。在33份垂穗披碱中（居群1和居群2）共检测到243条带，每个引物扩增产生的多态性条带在22～41条，平均每个引物产生30.38条带，其中多态性条带为27.25条;每个引物多态性百分率在57.14%～100%之间，平均多态性条带百分率为89.71%，多态性信息含量（PIC）在0.583～0.924之间，平均值为0.841（表3）。在25份达乌力披碱草（居群1和居群2）中扩增片段在100～500 bp之间，共检测到163条带，其中多态性条带为124条，平均多态性位点百分率为76.07%，每个引物产生的多态性条带在6～26条，平均每个引物产生20.37条带，多态性条带15.5条;多态性信息含量（PIC）在0.524～0.830之间，平均值为0.708（表3）。表3表明垂穗披碱草的扩增条带多态性显著高于达乌力披碱草。

2.3 遗传相似系数及聚类分析

在NTSYS软件中基于Dice遗传相似性系数（GS值）计算同域分布垂穗披碱草和达乌力披碱草居群的遗传相似系数。总群体遗传相似系数（GS）在0.083～0.919之间，变幅为0.836，平均值为0.434。居群1，30份供试材料间的GS值在0.091～0.880之间，平均GS值为0.487;居群2，28份供试材料之间的遗传相似性系数在0.125～0.966之间，平均值为0.489。垂穗披碱草和达乌力披碱草遗传相似性系数在0.083～0.919之间，变幅为0.836，平均值为0.434。在垂穗披碱草材料中，遗传相似性系数在0.071～0.919之间，平均值为0.426;达乌力披碱草材料中，遗传相似性系数在0.095～0.966之间，平均值为0.604。

基于遗传相似系数GS，采用UPGMA法可以将垂穗披碱草和达乌力披碱草明显分开（图2、图3）。

2.4 遗传多样性分析

POPGENE分析结果（表4）表明，同域分布垂穗披碱草的各个多样性指数都显著高于达乌力披碱草。居群1垂穗披碱草的多样性指数（Na=4.63，Ne=3.00，He=0.61，I=1.15，Pp=100%）均大于达乌力披碱草（Na=2.50，Ne=2.17，He=0.49，I=0.77，Pp =87.5%）;居群2垂穗披碱草多样性指数（Na=6.00，Ne=4.11，He=0.77，I=1.53）也均大于达乌力披碱草（Na=2.50，Ne=2.25，He=0.56，I=0.77）。从类群水平来看，垂穗披碱草的遗传多样性平均值（Na=5.32，Ne=3.56，He=0.69，I=1.34，Pp=100%）明显大于达乌力披碱草多样性指数平均值（Na=2.50，Ne=2.21，He=0.53，I=0.80，Pp=93.75%）。

2.5 两披碱草种内居群遗传分化

居群遗传结构分析结果（表5）表明，两种披碱草均存在居群遗传分化，垂穗披碱草的居群分化系数（Gst= 0.034）明显低于达乌力披碱草（Gst= 0.070），表明这两种披碱草的种内居群间遗传变异占总遗传变异的3.4%和7.0%，各自的绝大多数变异来自于各居群内（96.6%和93%）。根据遗传分化系数（Gst）计算得到两物种的居群间基因流较显著，分别为Nm=9.030和Nm=5.053。不同位点居群遗传分化程度存在差异，在垂穗披碱草居群间，位点ES-82和ESGS-328遗传分化程度最高（Gst=0.051），位点ESGS-117遗传分化程度最低（Gst=0.014）;在达乌力披碱草中，位点ES-82的分化程度最高（Gst=0.248），ESGS-117的遗传分化程度最低（Gst）=0.031。

分子方差分析结果（表6）表明，垂穗披碱草和达乌力披碱草的遗传变异主要存在于居群内。垂穗披碱草居群内遗传变异水平（80.92%）大于达乌力披碱草居群内（63.62%），垂穗披碱草种内居群间的遗传变异固定指数（Fst=0.19）低于达乌力披碱草种内居群间（Fst=0.36），两物种种内的居群遗传分化均达到显著水平（P<0.001）。AMVOA分析得到的遗传变异固定指数（Fst）和Wright的F统计量的Fst相当，都可得到不同地理分布居群间的基因流。根据公式Nm=0.25（1- Fst）/Fst，得到垂穗披碱草居群间的基因流（Nm=1.066）显著大于达乌力披碱草居群间的基因流（Nm=0.444），且两者均低于各自基于Gst计算的基因流（表5），由此说明地理居群间发生基因交流不显著，对居群的遗传分化并不能起到重要的作用。

2.6 同域分布居群披碱草种间遗传分化

从表7结果可以看出，同域分布披碱草种间的遗传分化系数平均仅为0.054，说明同域分布的垂穗披碱草和达乌力披碱草居群的遗传多样性主要存在于两近缘种内（94.6%）， 仅有5.2%分布于两物种间;同域分布的种间的基因流（Nm）达到了4.443，说明在同域分布的这两种披碱草属种间存在明显的基因交流;两个地区的同域分布的居群种间遗传分化分别为0.057和0.050，二者的差异程度不明显，这两种披碱草的基因流（Nm）很接近，分别为4.136和4.750，说明不同地区同域分布的这两种披碱草种间基因有明显基因流且交流程度很接近。

3 讨论与结论

高原地区垂穗披碱草呈现丰富的遗传变异性，对于该地区垂穗披碱草遗传多样性研究一向受到高原生态学家和牧草育种者的重视。Yan et al.（2009）对来自青藏高原不同海拔高度的14个垂穗披碱草居群共300多个个体，利用AFLP标记进行了遗传多样性评价，结果揭示不同居群位点多态性比例在33.21%～77.80%之间，总体为73.52%;基因多样性指数（He）在0.219 4～0.359 2之间，总体为0.428 5;香农多样性指数（I）在0.355 0～0.549 1之间，总体为0.619 8。Chen et al.（2013）对来自不同海拔高度的50多份垂穗披碱草材料，利用SSR标记进行了遗传性评价，结果揭示不同居群间位点多态性比例在54.86%～74.31%之间，基因多样性指数在0.162 9～0.198 7之间，香农多样性指数在0.257 9～0.311 9之间。我们利用SSR标记对来自2个不同居群的58个个体遗传多样进行检测，结果显示平均位点多态性比例达93.75%，基因多样性指数在0.61～0.77之间，总体为0.69，香農多样性指数在1.15～1.53之间，总体为1.34。在本研究中揭示的垂穗披碱草遗传多样性指标均高于前人的结果，这与不同研究中采用的分子标记类型不同有关，因为不同分子标记类型，多态性高低不同，最终导致研究结果差异的出现。Yan et al.（2009）利用AFLP标记得出多态性位点比例在66.3%～83.4%之间，平均为75.0%。本研究中SSR标记多态性位点比例在51.2%～96.2%之间，平均为90.4%。Chen et al.（2013）利用的SSR标记来源于普通小麦和Elymus alaskanus，在垂穗披碱草中位点多态性比例为66.7%～100%，平均为91.4%，但是平均多态性条数（7.33）和多态性信息含量（0.224）远低于本研究中SSR标记揭示的结果（分别为27.3和0.84）。究其原因，是因为本研究中利用的SSR标记来自于和垂穗披碱草同域分布的近缘物种老芒麦（E. sibiricus），因此，这些SSR标记在垂穗披碱草中更容易扩增出基因组中存在的多态性位点。

本研究揭示了垂穗披碱草遗传多样性高于同域分布的达乌力披碱草，但是在遗传结构上两个物种有相似之处。垂穗披碱草和达乌力披碱草自交结实率很高，为典型的自花授粉植物（Lu， 1993;德英等，2015）。通常自花授粉植物的遗传结构模式中，大部分的遗传变异应存在于居群间（Fahima et al.，1999），但本研究对青藏高原地区同域分布垂穗披碱草和达乌力披碱草遗传结构分析表明，垂穗披碱草和达乌力披碱草居群内遗传变异（96.6%和93.0%）显著高于居群间遗传变异（3.4%和7.0%），遗传变异主要存在于居群内个体间。AMOVA分析表明，垂穗披碱草和达乌力披碱草居群内遗传变异分别为80.92%和63.62%，居群间遗传变异仅为19.08%和36.38%。也有研究显示，利用不同遗传标记也揭示垂穗披碱草居群内部遗传多样性高于居群间的遗传结构特性（Yan et al.，2009;Chen et al.，2013）。Yan et al.（2010）进一步对高原地区垂穗披碱草遗传结构分析，认为由牲畜放牧带动种子产生的强基因流有可能是造成这种结果的原因。垂穗披碱草形态学显著区别于达乌力披碱草，垂穗披碱草下垂以及长的颖芒等特性似乎有利于种子通过动物毛发进行传播，但是达乌力披碱草直立、短芒或无芒的穗型似乎不利于这种传播方式。老芒麦为垂穗披碱草近缘物种，同样为青藏高原广为分布的优质牧草，老芒麦在外部形态上与垂穗披碱草非常相似，野外环境很难从形态学上区分二者。李永祥（2005）对中国境内老芒麦（包括来自青海的老芒麦居群）进行了遗传结构分析，结果表明老芒麦符合自花授粉植物的遗传结构特点，居群内遗传多样性指数为0.30，居群间为0.41，占全部多样性的58%。同为和垂穗披碱草形态相似的优质牧草物种，但老芒麦和垂穗披碱草在遗传结构特性上并不一致。由此我们推测，高原地区垂穗披碱草和老芒麦的群体遗传结构可能并不被流动放牧显著影响。

达乌力披碱草为达乌力披碱草复合群下的一个物种，达乌力披碱草复合群包含披碱草、麦宾草（Elymus tangutorum）、肥披碱草（E. excelsus）、圆柱披碱草（E. cylindricus）等（卢生莲等， 1987; Lu， 1993; Baum et al.， 2011; 颜济和杨俊良， 2013）。Agafonov（2001）对达乌力披碱草复合群物种的种间从形态学、贮藏蛋白和分子等三个不同水平上进行了详细的研究， 建议在合适的范围内定义为种内关系。李永祥（2005）利用SSR和ISSR对中国境内达乌力披碱草复合群种间亲缘关系进行了研究，结果表明在SSR和ISSR水平上几乎无法区分达乌力披碱草和圆柱披碱草。在本研究中达乌力披碱草取样地区为达乌力披碱草复合群物种多样性分布地区，同域分布有圆柱披碱草、麦宾草、肥披碱草等，同时考虑到该地区为达乌力披碱草复合群在该地区有特殊分化类型存在（李永祥，2005），因此，我们认为本研究中揭示的达乌力披碱草遗传多样性特性和遗传结构特点更有可能归因于达乌力披碱草居群内部已经存在的遗传分化。同样，我们推测同域分布的垂穗披碱草居群内存在的大量遗传变异，可能来源于该群体中存在的不同遗传分化类型。

披碱草属物种呈现复杂的网状进化特征，不同物种间杂交基因渗透普遍存在，种间杂交基因渗透在披碱草属物种多样性及遗传多样性形成中起着重要的作用（Sun et al.，2014; Wu et al.， 2016）。青藏高原地区为披碱草属物种多样性分布区域，在该地区存在丰富四倍体和六倍体披碱草属物种（卢生莲等，1987;刘尚武等，1999），研究表明垂穗披碱草和13种四倍体披碱草和4种六倍体披碱草物种间很容易杂交获得种子（Lu， 1993），另外在该区不同披碱草属物种间天然杂种高频率发生（相吉山，2008;刘晓燕，2017;陈丽丽等，2018;路兴旺等，2019）。同倍性或不同倍性物种间杂交在后代中产生较高的染色体变异（Lipmma et al.， 2013;Chester et al.， 2012），在我们的前期研究中发现垂穗披碱草群体中存在高频率染色体变异（Dou et al.， 2009， 2017）。因此，我们认为垂穗披碱草与同域分布的近缘物种间存在的种间杂交基因渗透有可能对于该群体的遗传分化起着重要的作用。与垂穗披碱草相比，达乌力披碱草复合群物种的核型相对保守，该复合群物种均具有2对物种特异性易位染色体存在（Dou et al.， 2011; Yang et al.， 2017），物种特异性易位染色体被认为在多倍体形成初期在核质互作中对细胞质的育性恢复和基因组稳定化选择中起着重要的作用（Gill， 1991），因此，达乌力披碱草和垂穗披碱草虽然都为基因组相似的同倍体物种，但是达乌力披碱草特殊的核质稳定机制可能对与不同披碱草物种间杂交基因渗透具有一定的阻碍作用，达乌力披碱草种群遗传分化更倾向与复合群内其他物种间的杂交基因渗透。本研究表明，同域分布的垂穗披碱草遗传多样性高于达乌力披碱草，相对于达乌力披碱草，这可能是由于垂穗披碱草更易与其他更多物种发生杂交基因渗透;不同居群中垂穗披碱草和达乌力披碱草之间有基因流存在，但是达乌力披碱草特殊的核质互作机制，可能在维持达乌力披碱草物种稳定性方面起著关键的作用。

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（责任编辑 李 莉）