项洋，郝力壮，柴沙驼

(青海大学畜牧兽医科学院 青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室青海高原牦牛研究中心，西宁 810016)

牦牛是生活在海拔3000m以上高寒地区的特有家畜品种，牦牛肉不仅具有高蛋白、低脂肪，富含矿物元素[1]，且是公认的无污染绿色食品[2]。随着人们生活水平的提高，绿色有机特色食品日益受到消费者关注和喜爱。近年来，由于畜产品市场不规范，消费者对动物源性食品安全越来越关注。因此，为保护牦牛这一特色畜产品，同时便于畜产品质量安全与监管，亟待解决产地溯源的技术问题，为牦牛肉优质优价提供技术支持。目前，稳定性同位素、矿物元素溯源技术是判别食品产地的一项有效的分析手段。国内外已有利用稳定性同位素溯源技术对羊肉[3] [4]、牛肉[5]、罗非鱼[6]、鸡肉[7]等溯源的相关研究报道，也有利用矿物元素溯源技术对羊肉[8] [9]、经济鱼类[10]、茶叶[11，12]、谷物[13]、葡萄酒[14，15]、咖啡[16]、橄榄油[17]、蜂蜜[18]等进行了溯源研究，但两种技术相结合溯源牦牛肉的研究未见报道。

由于动物源性食品生长环境多变，单一的溯源技术判别率受到饲喂方式、海拔高度、土壤环境等影响，研究复合溯源技术判别率为动物性食品溯源提供了选择。本研究将采用稳定性同位素和矿物元素组合技术分析，探索不同地域来源牦牛肉样品更为有效的溯源指标及方法，为复合溯源技术在牦牛肉上的应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

分别从青海省大通县、青海省河南县、四川省红原县、四川省九龙县4个牦牛肉主产地各随机采集10头3～5岁公牦牛背最长肌(10～14肋骨间)样品500g，放入自封袋在-20℃冰箱中冷冻保存。

石油醚(60℃～90℃沸程)，购自国药集团化学试剂有限公司；BV3级浓硝酸，购自北京化学试剂研究所；BV3级双氧水，购自北京化学试剂研究所；内标购自美国Agilent公司和国家标准物质中心。

1.2 仪器设备

TB-4002型电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷冻干燥机(Christ公司)；QM-3SP2型行星式球磨仪(南京大学仪器厂)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；2050 Soxtec型自动索氏提取仪(丹麦Foss公司)；vario PYRO cube元素分析仪(德国Elementar公司)；IsoPrime100稳定同位素质谱仪(英国Isoprime公司)；Mars 240/50微波消解仪(美国CEM公司)；Agilent 7700x ICP-MS(美国Agilent公司)。

1.3 实验方法

1.3.1样品前处理

1.3.1.1冷冻干燥 将样品切成1cm3小丁，平铺在托盘中冷冻干燥48h，取出后放入干燥器中保存。其中，真空冷冻干燥机冷限温度≤-62℃，真空度≤10Pa，相对湿度≤70%。

1.3.1.2粉碎 将冻干样品放入行星式球磨机中粉碎1h。其中，行星式球磨仪公转频率为44HZ，转速为290r/min，自转转速为580r/min。

1.3.1.3脱脂 称取2～3g粉碎好的牦牛肉样品，放在全自动索氏提取仪中，加入70mL的石油醚(沸程为60℃～90℃)。165℃浸泡30min，淋洗1h，溶剂回收10min，完成以上三步后将样品取出，此时为脱脂牛肉样品及粗脂肪样品，备用[19]。

1.3.2稳定性碳、氮同位素比率检测 称取2～4mg样品放入锡箔杯中，通过自动进样器进入元素分析仪，在其内燃烧并还原转化为纯净的CO2和N2，CO2再经过稀释器稀释，最后进入稳定同位素质谱仪进行检测。具体工作参数如下：

元素分析仪条件：燃烧炉温度为1020℃，还原炉温度为600℃，载气He流量为230 mL/min。

稀释仪条件：He稀释压力为4bar，CO2参考气压力为4bar，N2参考气压力为4bar。

质谱仪条件：用USGS24(δ13CPDB=-16‰)标定钢瓶CO2参考气，采用两点校正，用USGS24和IAEA600(δ13CPDB=-27.5‰)对测定结果进行校正；用IAEA N1(δ15Nair=0.4‰)标定钢瓶N2参考气，用IAEA N1和USGS43(δ14Nair=8.44‰)对测定结果进行校正。

稳定性碳、氮同位素比率分别以δ13C‰，δ15N‰表示，其中，稳定性碳同位素相对标准为V-PDB，稳定性氮同位素相对标准为空气(Air)。

1.3.3稳定性氢同位素比率检测 称取0.3mg样品装入银杯(6mm×4mm)，平衡72h，并按顺序放入120位自动进样器中，利用自动进样器将样品送入元素分析仪，高温裂解生成CO和H2，最后进入稳定同位素质谱仪进行检测。具体的工作参数如下：

样品裂解温度为1450℃，He载气流速为120 mL.min-1，H2参考气压力为4bar；

稳定性氢同位素比率以δ2H‰表示，其中，稳定性氢同位素相对标准为V-Smow；

稳定性碳、氮、氢同位素测定结果的计算为：δ‰=(R样品/R标准-1)×1000，式中，R代表标准物质和样品中轻重同位素与轻同位素的丰度比，即分别为13C/12C，15N/14N，2H/1H。

1.3.4矿物元素检测 称取0.2g左右的牦牛肉粉样品，置于洁净的消解管中，加入6mL BV3级浓硝酸预消解1h，之后加入2mL BV3级双氧水预消解0.5h，放入微波消解仪中进行消解。

1.3.4.1微波消解条件 微波在8min内从0℃增加至120℃，在此条件下保持2min；5min内从120℃增加至160℃，在此条件下保持5min；5min内从160℃增加至180℃，在此条件下保持15min。消解后用超纯水定容至100mL。

1.3.4.2将定容好的样品用ICP-MS进行检测ICP-MS自动进样器参数：样品快速提升2mL/min(0.5rps)40s；分析前稳定0.4rps 30s；多元素同时分析0.1rps；ICP-MS定量分析模式：He气模式，单位质量数采集数采集点数为3，数据采集重复次数为3次，积分时间As为1s，Se、Cd为2s，Pb为3s，其他元素为0.3s；ICP-MS具体工作参数：射频功率为1600W，载气流速为1.0L/min，蠕动泵流速0.1rps，雾化室温度为2℃，氧化物指标为0.45%，双电荷指标为1.01%；使用外标法进行定量。采用Ge、In、Bi等多元素混合作为内标，其中Ge(72)作为质量数9～89各元素内标；In(115)作为质量数95～159各元素内标；Bi(209)作为质量数163～238各元素内标。当内标元素RSD值大于3%时，样品需重新测定。

1.4 数据分析处理

采用SPSS19.0软件对数据进行Duncan’s多重比较，独立样本非参数检验，进行判别分析、主成分分析和聚类分析。判别分析采用逐步判别分析，先验概率选择“根据组样品数计算”。聚类分析采用系统聚类，其中聚类距离为欧式距离，聚类方法采用离平方和法。

表1 不同地域间牦牛肉中稳定性同位素组成差异分析

2 结果与分析

2.1 不同地域间牦牛肉中稳定性同位素组成差异分析

通过使用IRMS测得河南县、大通县、红原县及九龙县4个县牦牛肉中的δ13C值，结果如表1所示。由表1可知，4个地域间牦牛肉中的δ13C的平均值由大到小依次为：河南县>红原县>九龙县>大通县。通过Duncan法多重比较发现红原县与其他3县有显著差异(P<0.05)，但九龙县与青海省两县无显著差异。四川两县样品的变异系数均大于青海两县，说明青海的数据分布较四川两县均匀。

4个地域间牦牛肉中δ15N的平均值由大到小依次为大通县>红原县>九龙县>河南县。经Duncan法多重比较可看出大通县、红原县无显著差异(P>0.05)，河南县、九龙县无显著差异(P>0.05)，但大通县、红原县与河南县、九龙县有显著差异(P<0.05)。通过变异系数可看出青海省大通县变异系数最小。

4个地域间牦牛肉中δ2H的平均值由大到小依次为大通县>河南县>红原县>九龙县。4个地区间差异显著(P<0.05)。四川省九龙县变异系数较大可能是其中有两个样品数值与其他样品相差较大而造成。总体而言，4个县中青海省的两个县变异系数由大到小排序顺序相一致，四川省则有所不同。

2.2 不同地域间牦牛肉中矿物元素组成差异分析

对3个地域牦牛肉样品中的50余种矿物元素进行方差齐性检验及单个样品K-S检验，结果显示，大部分矿物元素不服从正态分布。利用Kruskal-Wallis H检验得出Na、Fe、As、Se、Mo、Cd、Cs、Ti 8种矿物元素存在显著差异(p<0.05)。大通县除矿物元素Cs低于四川两县，其余矿物元素均高于其他3县。矿物元素Na、Fe由大到小排序均为大通县>红原县>九龙县>河南县；矿物元素Se、Mo由大到小排序均为大通县>河南县>红原县>九龙县；矿物元素Cd由大到小排序均为大通县、九龙县>河南县、红原县。矿物元素Cs由大到小排序均为红原县>九龙县>大通县>河南县；矿物元素Ti由大到小排序均为大通县>河南县、红原县、九龙县。红原县大部分矿物元素的变异系数大于其他3县，说明红原县采样较不均匀。

表2 不同地域牦牛肉样品中矿物元素组成

2.3 主成分分析

从牦牛肉样品中筛选出的δ13C、δ15N、δ2H三种稳定性同位素指标和Na、Fe、As、Se、Mo、Cd、Cs、Ti8种矿物元素指标做主成分分析，结果表明，前3个主成分的累计方差贡献率为68.451%，矿物元素Na、Fe是第一主成分主要包含的信息，占方差贡献率的36.048%；稳定性氮、氢同位素和矿物元素Ti是第二主成分主要包含的信息，占方差贡献率的19.876%；稳定性碳同位素是第三主成分主要包含的信息，占方差贡献率的13.221%。

利用前3个主成分标准化得分做散点图，大通县样品和九龙县大部分样品分别位于第二主成分的正、负两侧；河南县的样品较为集中，红原县的样品较为分散，但总体来说，以上提取的主成分可将4个县的样品完全区分开。

表3 主成分的特征向量及累计方差贡献率

图1 牦牛肉样品主成分标准化得分图

2.4 聚类分析

在距离为5的位置将树切断，可将其分为5类。第一类大部分为大通县样品，占样品总数量的90%，其中含有红原县样品1个；第二类全部为红原县样品，占样品总数量的50%；第三类样品主要是九龙县样品，占样品总数量的80%，其中还包括3个红原县样品；第四类包含4个县的样品，河南县的样品数量最多；第五类全部是河南县样品，占样品总数量的70%。

图 2 牦牛肉聚类分析图(1.河南县;2.大通县;3.红原县;4.九龙县)

2.5 判别分析

为了进一步证实同位素指标与矿物元素指标结合对牦牛肉产地判别的可行性，对地域间差异显著的同位素及矿物元素进行判别分析。先后有稳定性碳同位素、稳定性氢同位素、矿物元素Ti 3种指标引入判别模型中，并建立如下的判别模型：

Y河南县=-5170.804-427.879δ13C-

0.401δ2H+40486.142Ti

Y大通县=-5348.870-435.115δ13C-

0.374δ2H+44043.218Ti

Y红原县=-5393.637-436.267δ13C-

0.543δ2H+41929.526Ti

Y九龙县=-5208.884-427.786δ13C-

0.693δ2H+41771.548Ti

对3种同位素和八种矿物元素进行判别分析结果如下，4个县中除了大通县的交叉验证判别率较整体正确判别率有所下降，其余县都未发生变化。其中，河南县判别率最高；大通县有两个样品被错判到河南县；红原县和九龙县整体正确判别率和交叉验证判别率都为80%，红原县样品被错判到河南县和九龙县；九龙县样品被错判到青海省两县，但总的来说整体判别效果较好，总的交叉验证判别率只略低于整体正确判别率的2.5%。

3 讨论

由于环境因素影响最终会使动物组织中稳定性同位素含量有所不同，因此使用IRMS鉴定肉类来源已得到认可。稳定性碳和氮同位素已成功对中国不同地区的牛肉进行了分类[20]。有研究表明，在巴塔哥尼亚南部广阔草原地区生长的草中矿物质含量受环境和地域差异的影响[21]，肉中矿物元素组成受环境(水、食物)[8]及成土母质的影响。因此，由于环境的影响不同地域来源的牦牛肉样品中矿物元素含量也有所差异。本研究也表明，青藏高原四个地区的牦牛肉中稳定性同位素、矿物质元素含量因其地理起源而有所不同。

表4 牦牛肉产地的正确判别率

由于地理分布、土壤形成和气候差异很大，因此可以在广阔的地理区域(即不同的国家)中区分肉类来源。先前已经证明了使用稳定性同位素或矿物元素溯源技术可以对不同来源的肉进行分类，例如可以用于牛肉[5]、羊肉[3,4,8]、家禽[7]和猪肉[22]，该技术可将肉追溯到不同省份或国家。本研究结果表明，使用稳定性同位素和矿物元素组合技术可将牦牛肉的来源在较小范围内进行区分，即在相同省内不同区县之间。不同地域牦牛肉样品按其来源分类的整体正确判别率为85%，交叉验证判别率较整体正确判别率仅低2.5%。尽管本研究的样本量较小，但PCA和LDA能够清楚识别来自不同来源的牦牛样本，为使用稳定性同位素与矿物元素组合鉴定牦牛肉来源提供了一定的基础。

4 结论

本研究证实牦牛肉可以根据其地理来源使用稳定性同位素及矿物元素组合技术进行认证。通过多元统计分析从3种稳定性同位素及50多种矿物中筛选了δ13C、δ2H、Ti 3种元素，并建立了牦牛肉可追溯性的判别模型。多元统计分析得出的总体正确分类率为85%，交叉验证率为82.5%，判别效果较理想。