樊帅, 刘坤, 金媛媛, 杨兆勇

中国医学科学院医药生物技术研究所, 北京 100050

D-对羟基苯甘氨酸是一种重要的精细化工品，广泛应用于药学领域。β-内酰胺类抗生素类药物(如阿莫西林、头孢拉定和头孢立新等)的侧链化合物、肽激素和拟除虫菊酯的合成都需要D-对羟基苯甘氨酸[1]，并可以用作磷和硅的分析试剂。目前D-对羟基苯甘氨酸采用酶法制备，即由D-海因酶和D-氨甲酰水解酶偶联酶法制备D-对羟基苯甘氨酸[2](图1)，该方法具有环境友好、底物转化率高、产物光学活性单一和反应条件温和等特点。D-海因酶(D-hydantoinase，EC 3.5.2.2,HYD)作为酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的关键酶，广泛存在于细菌、真菌和植物中。HYD能特异性地将D-单替代海因水解为N-氨甲酰基-D-氨基酸，而L-单替代海因在碱性条件下消旋转化为D-单替代海因，进而使得HYD能够将D,L-单替代海因 100 %转化为光学纯的N-氨甲酰-D-氨基酸。

图1 D-海因酶和氨甲酰基水解酶催化过程

D-海因酶主要来源于微生物，如Burkholderiapickettii[3]、Bacillusstearothermophilus[4]、Pseudomonasfluorescens[5]和Pseudomonasputida[6]等，不同来源的HYD最适反应温度一般为30～60 ℃，耐热性较差，限制了其在工业酶法制备D-对羟基苯甘氨酸中的应用。现阶段，针对D-海因酶活性和耐热性较差的缺点，不同研究者利用不同方法对D-海因酶进行改造。Chern 等[7]对源于BacilluscirculansHYD的C-末端连入几丁质结合结构域，利用几丁质固定化重组HYD，将其45 ℃ 的半衰期延长至270 h；Kim等[8]构建了D-海因酶和D-氨甲酰水解酶的融合酶，并利用定向进化筛选获得活性提高的突变体；Aganyants 等[2]通过对底物结合的关键氨基酸Phe159和Trp287突变，改变了来源于BacillusstearothermophilusHYD的底物特异性。……