罗丹 覃慧芳 叶婧 赵锦明 秦翊翔 蓝如束

广西壮族自治区结核病报告发病率尽管近年来以3.39%的年均递减率逐年下降，但仍居于全国各省(市、自治区)前列[1]。广西壮族自治区结核分枝杆菌抗结核药物耐药率虽低于全国平均水平[2]，但是结核病患者基数大，结核病耐药问题给本地区结核病防控带来严峻挑战。本研究运用全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)的方法，探讨结核分枝杆菌耐药相关基因突变情况及其与基因型的相关性，以期为耐药结核病的早诊断、早治疗提供科学参考。

资料和方法

一、菌株来源

对2017年广西壮族自治区结核病耐药监测点的所有涂阳肺结核患者痰标本进行分离培养，获得阳性培养物,最终获得721株结核分枝杆菌。1株由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供的H37Rv结核分枝杆菌标准菌株作为对照。

二、实验方法

1.菌株培养：将含有菌液的冻存管放置37 ℃恒温培养箱中复苏。吸取0.1～0.15 ml菌液均匀接种于培养管的罗氏培养基上，每株菌接种2支培养管，将培养管放置37 ℃恒温培养箱中孵育。具体操作参考《结核病实验室检验规程》[3]。培养基购自珠海贝索生物技术有限公司。

2.DNA的提取：采用CTAB法进行DNA的提取[4]，提取的DNA置-20 ℃保存备用，作为WGS的DNA模板。

3.WGS：由北京诺禾致源生物科技股份有限公司完成检测，利用高通量二代Illumina 测序技术平台，进行DNA 片段文库构建，双端测序，PE150，深度至少200×，每个样品总测序深度数据量≥1 G Clean Data。测序原始数据分别用Scythe (https://github.com/ucdavisbioinformatics/Scythe)和Sickle (https://github.com/najoshi/sickle)两个软件进行过滤处理，去除低质量碱基(质量值≤38)、N 碱基比例>10 bp、与Adapter 之间overlap 超过15 bp和可能来源于宿主的reads，得到的Clean Data用于后续分析。以H37Rv菌株的全基因组序列(NC_000962.2)作为参考模板，使用Samtools软件进行比对获得每株菌株单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)[5]。将SNP数据与已报道结核分枝杆菌耐药基因突变数据库进行比对[6]，获得每株菌株对一线抗结核药品耐药突变基因的类型。菌株分型是将每株菌株SNP与H37Rv(NC_000962.2)进行比对，获得每株菌株的基因型[7]。

三、统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据的整理与分析，计数资料采用“率或构成比(%)”表示， 组间差异的比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

结 果

一、结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变类型

WGS结果显示，721株结核分枝杆菌中，223株发生了5种抗结核药品耐药相关基因突变，总突变率为30.93%，其中单药突变126株(56.50%，126/223)，多药联合突变97株(43.50%，97/223)。在5种抗结核药品中，链霉素的单药突变比例最高(44.00%)，其次是异烟肼(40.85%)、吡嗪酰胺(33.33%)、乙胺丁醇(17.19%)、利福平(17.05%)；多药联合突变中，利福平的多药联合突变比例(82.95%，73/88)高于其他药品(χ2=25.660，P=0.000)(表1)。

二、结核分枝杆菌临床分离株基因突变位点分布情况

分别对5种药品的耐药基因突变情况分析得出，突变率最高的基因为katG基因，突变率为16.09%(116/721)，其次由高到底依次为：rpoB(12.21%，88/721)、embB(8.46%，61/721)、rpsL(6.10%，44/721)、rrs(4.72%，34/721)、pncA(3.61%，26/721)(表2)。

表1 2017年广西分离结核分枝杆菌对5种抗结核药品耐药基因突变类型

对突变率前5位的耐药基因katG、rpoB、embB、rpsL、rrsL进行突变位点分析显示，在katG基因突变的116株菌株中，单位点突变占94.83%(110/116)，多位点联合突变占5.17%(6/116)。突变率最高的位点为katG315，突变率12.34%，占katG基因总突变的85.34%(99/116)，其中以AGC→ACC碱基突变为主，占katG315位点突变的89.90%(89/99)。在rpoB基因突变的88株菌株中，单位点突变与联合突变之比为3:1(66/22),突变率最高的位点为rpoB450，突变率4.85%，占rpoB基因总突变的39.77%(35/88)，突变碱基均为TCG→TTG，其次的突变位点为rpoB445(占23.86%，21/88)，rpoB452(占5.68%，5/88)，发生前 3 个位点突变的菌株数占rpoB总突变菌株数的69.32%。在embB基因突变的61株菌株中,单位点突变31株(50.82%)，联合突变30株(49.18%)；embB306位点突变率最高(4.02%，29/721)，占embB基因总突变的50.82%，多位点联合突变以embB378+embC270突变为主(60.00%，18/30)。在rpsL基因突变的44株菌株中,单位点突变41株，占93.18%；以rpsL43位点突变为主，突变率为5.27%，占rpsL总突变的86.36%(38/44)。在rrs基因突变的31株菌株中,以rrs462单位点突变和rrs516单位点突变为主(67.74%，21/31)。突变率前5位的位点分布情况见表3。

吡嗪酰胺耐药基因突变率为3.74%(27/721)。在27株发生吡嗪酰胺耐药基因突变的菌株中，26株(96.30%)发生pncA基因突变，仅有1株(3.70%)发生pnaD基因突变。突变形式以单位点突变为主(92.59%，25/27)。

表3 721株结核分枝杆菌临床分离株基因突变位点分布情况

表4 721株结核分枝杆菌耐药基因突变在不同基因型中的分布

表5 721株结核分枝杆菌耐药基因突变位点在不同基因型中的分布

三、结核分枝杆菌耐药基因突变与基因型的相关性

721株结核分枝杆菌中，北京基因型菌株409株(56.73%)，非北京基因型菌株312株(43.27%)。对突变率较高的5个耐药基因katG、rpoB、embB、rpsL、rrs的突变情况在不同基因型中的分布进行分析发现，rpsL基因突变在2种基因型中分布的差异有统计学意义(χ2=32.090，P=0.000)(表4)。

对突变率前5位的耐药基因位点katG315、rpoB450、rpsL43、embB306、rpoB445在不同基因型中的分布进行分析显示，rpsL43位点和rpoB445位点在北京基因型中的突变率高于非北京基因型(χ2=26.992，P=0.000；χ2=7.404，P=0.007)(表5)。

讨 论

国内外对一线抗结核药品耐药基因突变的研究较为广泛。相关研究表明，不同地区结核分枝杆菌耐药基因是否突变以及突变位点均存在较大差异[8]。广西壮族自治区地处祖国西南边陲，结核病疫情严重，耐药结核病给本地区结核病控制带来严峻挑战。基因突变是结核分枝杆菌耐药的主要机制，而目前尚未有关于广西壮族自治区结核分枝杆菌耐药基因突变情况的研究报道，本地区结核分枝杆菌相关耐药基因突变与结核分枝杆菌基因型是否相关亦未得知。本研究采用WGS的方法，探讨了广西壮族自治区结核分枝杆菌对5种一线抗结核药品异烟肼、利福平、链霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇耐药相关基因突变情况及其与基因型的相关性，为耐药结核病的早诊断、早治疗提供技术依据。

本研究的5种一线抗结核药品中，链霉素和异烟肼发生单药突变的比例较大，分别占总突变的44.00%和40.85%，而利福平和乙胺丁醇则以与其他药品发生联合突变为主，分别占82.95%和82.81%。因此，在发生利福平和乙胺丁醇耐药基因突变的菌株中，应警惕其他药品相关基因同时发生突变的存在，为临床用药提供参考。对各药品相关耐药基因的分析显示，突变率在前5位的基因分别是异烟肼katG、利福平rpoB、乙胺丁醇embB、链霉素rpsL和rrs基因，与国内外相关研究基本相同[9-10]。值得注意的是，本研究rpoB基因突变率为12.21%，与国内数据相比较高[11]，然而，前期在本地区开展的结核病耐药性监测结果并未显示本地区利福平耐药表型水平高于全国平均水平，考虑可能与本地区rpoB基因突变的位点以rpoB450和rpoB445为主有关，相关研究表明绝大多数rpoB耐药相关突变发生于利福平耐药决定区(RRDR)，即密码子507～533这一81 bp区域，占全部rpoB耐药相关突变的95%～97%，其中最常见的是密码子516、526、531[12-13]，而本地区rpoB突变位点位于RRDR区以外，此外，耐药的产生不仅与突变位点有关，不同碱基突变类型导致的耐药水平也不同。对各基因发生突变位点的进一步分析发现，katG、rpoB、rpsL和rrsL基因均以单位点突变为主，而embB基因约50%发生多位点联合突变，尤其以embB378+embC270联合突变为主。提示在进行耐药结核病分子诊断方法的制定时应充分考虑各位点突变的特征，本结果可为耐药分子诊断制剂的研发提供一定的参考。

本研究异烟肼耐药基因katG突变位点、氨基酸变化与相关研究结果一致[14-15]。katG基因突变导致异烟肼耐药的原因主要是315位点的丝氨酸转变成苏氨酸，使得katG编码的过氧化氢-过氧化物酶活性下降或丧失，导致异烟肼无法活化为异烟酸，致使结核分枝杆菌产生耐药性[16]。本研究还发现了异烟肼fabG1和ahpC基因发生了突变，值得注意的是，在6株异烟肼耐药基因联合突变的菌株中，均有fabG1基因突变的发生，这对广西壮族自治区耐药结核病的基因诊断有一定的参考意义。利福平耐药基因rpoB突变率最高的位点为450，碱基由TCG 突变为TTG，氨基酸由丝氨酸转变成亮氨酸，此外，rpoB445位点突变率也较高，这与Nwofor 等[17]的研究结果不相同，可能与研究的地区、民族差异性有关，结核分枝杆菌耐药率及耐药基因突变特征在不同民族中可能存在差异[18-19]。乙胺丁醇耐药基因embB突变位点为406，碱基主要由 ATG 转换为 GTG、ATA、ATC、ATT，氨基酸由甲硫氨酸转变成缬氨酸和异亮氨酸。这与相关报道[20-21]相符。链霉素耐药基因rpsL和rrs的突变最常见的位点分别是43、1401[22]。本研究中rpsL与rrs的突变位点及氨基酸变化与相关研究结果一致[23-24]。rpsL和rrs的突变分别导致糖体蛋白S12与核糖体16S RNA的编码发生障碍，从而使结核分枝杆菌对链霉素产生耐药[25]。本研究在721株结核分枝杆菌中仅发现有27株发生了吡嗪酰胺耐药相关基因突变，突变率不高，突变基因也仅有pncA和pnaD2个，突变形式也比较单一，以单位点突变为主。本研究结果一定程度上反映了本地区吡嗪酰胺的耐药水平，说明一线抗结核药品吡嗪酰胺在本地区仍具有较高的应用价值。

本研究在探讨耐药基因突变与基因型的相关性中发现，突变率前五位的5个基因中，链霉素rpsL基因突变在北京基因型中的发生率高于非北京基因型；在突变率前五位的5个耐药基因位点中，链霉素rpsL43位点和利福平rpoB445位点突变率在北京基因型中也高于非北京基因型，这与北京基因型更容易传播耐药菌株的结论具有一定的一致性，本研究未发现异烟肼和利福平耐药基因突变与基因型有相关性，考虑有可能与样本的局限性有关，可进一步增大样本含量进行研究。然而，北京基因型是否更容易发生上述相关耐药基因的突变，仍需要进一步研究证实。

本研究通过WGS揭示了广西壮族自治区结核分枝杆菌对5种一线抗结核药品利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和链霉素耐药相关基因突变的分子特征，在分子水平上快速确定其对一线抗结核药品基因型耐药情况，与传统药物敏感性试验6～10周的检测时间相比，极大缩短了检测报告时间，大大缩短了耐药结核病患者的确诊周期，具有较高的临床应用以及推广价值。随着分子检测技术的日趋完善，其在结核病耐药筛查、相关耐药基因的分子快速诊断试剂盒的研发与应用方面具有重要的应用前景。