徐峥嵘

(甘肃省动物疫病预防控制中心，兰州 730000)

1 材料与方法

1.1 试验设备及材料

试验动物：试验所用实验动物均为做过PPD变态反应的奶牛，共计350头。

试验试剂：牛分枝杆菌重组抗原，采购自哈尔滨兽医研究所；牛结核病标准阴性血清，牛结核病标准阳性血清，均采购自哈尔滨兽医研究所。

其他所需试剂：兔抗牛IgG-HRP(辣根过氧化物酶)工作液、柠檬酸—磷酸盐片、邻苯二胺(OPD)、3%H2O2、磷酸盐—吐温缓冲液PBST、氯化钠、浓硫酸等。

试验仪器及耗材：高速冷冻离心机、酶标仪680型、恒温箱、微量移液器、高压灭菌锅、电子天平、低温冰箱、容量瓶、烧杯、移液器、量筒、广口瓶、锥形瓶、离心管、TIP头、采血管、手术剪、镊子、一次性聚乙烯手套、口罩、乳胶手套、记号笔、标签纸、酒精棉球、计时器、报纸、棉线等。

1.2 牛结核病ELISA检测方法操作步骤

1.2.1 抗原包被 首先用碳酸缓冲溶液按照1∶600的比例将牛分枝杆菌重组抗原进行稀释，然后依次加入50 μL稀释抗原溶液与96孔微型板上，对照组加碳酸盐缓冲溶液，振荡混匀，加样过程中每加一个孔必须换一个TIP头。用封板膜封板后，放置于37 ℃恒温箱内，静置90 min。

1.2.2 洗 板 慢慢揭开封板膜，将96孔微型板中的抗原包被液弃去，甩干之后在每孔加满配制好的PBST溶液，吹吸混匀，静置30 s后弃去，如此重复5次，最后在吸水纸上用力拍干，使洗液残留量程度达到最低。

1.2.3 洗 板 洗板方法同1.2.2，反复洗板5次，拍干反应板中的残留液体。

1.2.4 加牛血清 将待检奶牛血清稀释1∶200倍，用微量移液器加入到96孔微型板中，每孔50 μL，充分吹吸混匀。分别设置阳性对照孔和阴性对照孔各2个，将阳性、阴性血清稀释1∶100倍稀释，用微量移液器吸取50 μL稀释液分别加入到96孔微型板相应对照孔内，放置于37 ℃恒温箱内，静置60 min。……