李国泽 李雪 陈蔼仪 赵平 杨玲 丁勇

摘要：樟叶越橘是具有重要药用和经济价值的特色资源植物，其野生资源日益匮乏，比较其主效成分在组培和野生植物中的含量差异，可为利用组培樟叶越橘大量获取主效成分提供科学依据。应用高效液相色谱（HPLC）技术测定了樟叶越橘组培与野生植物不同部位中6′-O-咖啡酰熊果苷（6′-O-caffeinylarbutin，CA）、绿原酸和熊果苷3种主效成分含量，并进行了比较分析。结果表明，3种主效成分在樟叶越橘组培与野生植物的不种组织部位中的含量存在差异，在成熟叶片和叶芽组织中组培樟叶越橘具有高于野生植物的主效成分含量。各主效成分含量在不同种源樟叶越橘成熟叶片中差异显著，组培樟叶越橘的CA和绿原酸含量均显著高于野生植物（P<0.05）。因此繁育的组培樟叶越橘不仅解决了樟叶越橘野生资源匮乏和取材困难问题，还具备了替代野生植物大量提取获得主效成分的潜能。建议后期可将组培樟叶越橘植物规模化生产并推广种植。

关键词：高效液相色谱;樟叶越橘;组培樟叶越橘;野生植物;主效成分

中图分类号：R284 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）07-0175-05

收稿日期：2020-07-28

基金项目：国家自然科学基金（编号：31960073、31460076）;云南省高校林木生物技术重点实验室开放基金（编号：51700201）。

作者简介：李国泽（1994—），女，云南保山人，硕士研究生，主要从事樟叶越橘生物技术研究。E-mail：2714021549@qq.com。

通信作者：丁 勇，硕士，副教授，主要从事植物生物技术与分子生物学研究。E-mail：dingyong@swfu.edu.cn。

樟叶越橘（Vaccinium dunalianum Wight）别称饭米果（云南昆明）、长尾越橘，是杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）多年生常绿稀攀援灌木[1-2]。樟叶越橘全株可入药，性味微苦，微温，具有祛风除湿、舒筋活络、治疗风湿关节疼等多方面的生理功能[3]，是独具特色的民族药物。在云南武定彝族民间因樟叶越橘幼嫩叶芽外形呈锥形，似雀嘴，称其加工品为雀嘴茶[4]。研究表明，熊果苷、绿原酸以及6′-O-咖啡酰熊果苷（CA）是樟叶越橘的3种主效成分[5]。熊果苷及其衍生物CA具有明显抑制黑色素生成的皮肤美白活性[6]，可用于化妆品皮肤增白剂[7-9]和黄褐斑的临床治疗[10]。绿原酸具有消炎抗菌[11-12]、抗肿瘤[13-14]、预防心血管疾病[15-16]等广泛的生物活性。因此，具有民族药用资源特色的樟叶越橘植物在食品保健、日用化工以及医药等多个领域具有广泛的应用前景。

樟叶越橘植物生长慢、分布量有限，又因雀嘴茶生产被连年破坏性采摘，导致其野生资源急剧减少。为解决资源短缺问题，已经采用植物组织培养快速繁殖技术开展了樟叶越橘无性繁育工作[17-20]。进一步开展樟叶越橘组培驯化植物中主效成分含量及与野生植物中的差异研究，能为以樟叶越橘组培苗为材料开展其主效成分研究及樟叶越橘资源的可持续开发利用提供实验基础和技术保障，而目前此方面工作未见报道。鉴于此，本研究以樟叶越橘组培和野生植物为材料，应用高效液相色谱（HPLC）技术测定了不同种源樟叶越橘不同组织部位中熊果苷、绿原酸和CA的含量，并进行了含量差异性比较，为开发樟叶越橘组培驯化植物替代野生植物提取有效活性成分的潜能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用不同组织材料为2019年4月采自樟叶越橘野生和组培樟叶越橘的叶芽、花芽和成熟叶片（表1）。野生植物来源于云南省武定县新村村、滑坡村和永泉村3个样点，取生长良好、无病虫害的鲜新叶芽、花芽和成熟叶片，成熟叶片采样以枝条顶端叶为第1张叶，在第2～4张叶中任取2张健康成熟的叶片为试验材料，装入信封袋带回实验室。组培樟叶越橘为课题组前期繁育，按照罗旭璐等的方法[17]进行组培初代启动培养和增殖继代，培养基分别为木本植物用培养基（WPM）+3.00 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）+0.20 mg/L 萘乙酸（NAA）和WPM+2.00 mg/L 玉米素（ZT），培养温度为 （25±2） ℃，光照度30～50 μmol/（m2·s），每天光照 12 h;按照赵展平等的方法[18]进行組培苗生根和移栽驯化，生根培养基为1/4 MS+2.00 mg/L 吲哚乙酸（IBA）+0.10 g/L活性炭+15.00 g/L蔗糖，培养条件同上;移栽驯化基质为全腐殖土;后培养在西南林业大学树木园基地，已连续生长3年，叶芽、花芽和成熟叶片，取样方法同上。

1.2 试剂

HPLC用甲醇为德国Merck公司产品（色谱纯）;提取用甲醇（分析纯）和冰乙酸购自天津市大茂化学试剂厂;熊果苷和绿原酸标准品购自上海源叶生物科技有限公司（纯度 ≥ 98%）;6′-O- 咖啡酰熊果苷（CA）为笔者所在课题组前期从樟叶越橘中提取分离获得（纯度 ≥ 95%）。

1.3 材料预处理

将试验样品装在铝质干燥盒中放于理化干燥箱（LG100B，上海市实验仪器总厂）中45 ℃恒温干燥至恒质量（SOP型电子分析天平，德国Sartorius公司，前后2次称量差异在5‰以内），放入高速万能粉碎机中粉碎（过40目筛），密封于50 mL离心管中装好。测定前，将样品置于干燥器中平衡过夜。

1.4 HPLC色谱条件

参照文献[21]，HPLC色谱柱为F90104 CAPCELL PAK C18 MG （S-5）（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A和B分别为1%冰乙酸和甲醇（预处理：流动相于超声波清洗器上超声19 min，去除流动相中的气泡以避免损坏液相色谱仪和色谱柱），流速1 mL/min，梯度洗脱条件：0～<10 min，95%A，5%B;10～<50 min，85%A，15%B;50～<55 min，35%A，65%B;55～<70 min，5%A，95%B;≥70 min，95%A，5%B。柱温25 ℃，检测波长280 nm，进样体积10 μL。

1.5 HPLC标准品制备

分别精确称取熊果苷、CA及绿原酸3种标准品，配制成起始质量浓度为1.20 mg/mL熊果苷、3.00 mg/mL绿原酸以及6.00 mg/mL CA的标准品溶液，依次等体积稀释6次，最终稀释为终浓度0.02 mg/mL熊果苷、0.05 mg/mL绿原酸以及 0.09 mg/mL CA标准品溶液，过滤（0.45 μm滤孔滤膜）后注入液相色谱瓶中，按“1.4”节的色谱条件在高效液相色谱仪（Waters 2695，美国Waters公司）进行HPLC分析检测，建立3种主效成分的标准曲线。

1.6 HPLC标准曲线的建立

取不同质量浓度熊果苷、绿原酸、CA标准品溶液，在上述色谱条件下依次进样，以标准品浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），计算线性回归方程。

1.7 样品含量测定

参照文献[22] 的提取主效成分方法，精确称取粉碎样品0.10 g，3个重复。73%甲醇超声19 min（LU10AT型超声波清洗仪，上海冠特超声仪器有限公司），料液比1 g ∶16 mL，5 000 r/min离心2 min（CF16RXⅡ台式高速冷冻离心机，日本HITACHI公司），提取4次，各取1 mL上清提取液等体积混匀，过0.45 μm滤孔滤膜后注入棕色色谱小瓶，滤液以进样体积10 μL分别进样，记录各供试样品中3种主效成分的色谱出峰面积，分别代入线性回归方程，计算其在不同组织样品中的含量。

1.8 分析方法

运用Excel 2010统计处理试验数据，结果用平均值±标准差表示;运用SPSS 21.0软件进行单因素ANOVA方差分析（LSD法和Duncans法）。

2 结果与分析

2.1 HPLC标准曲线的建立

以标准品质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）绘制标准品的标准曲线，CA回归方程为y=9×106x+1 328.1，r2=0.999 8;绿原酸回归方程为y=1×107x-437 086，r2=0.999 3;熊果苷回归方程为y=4×106x+10 088，r2=0.999 8。标准品CA、绿原酸、熊果苷分別在0.90～60.00、0.50～30.00、0.20～6.00 μg范围内，r2均大于0.999，线性关系良好。

2.2 樟叶越橘组培与野生植物不同部位中主效成分含量比较

表2为樟叶越橘组培与野生植物成熟叶片、叶芽和花芽3种组织中CA、绿原酸和熊果苷3种主效成分含量。可以看出，组培樟叶越橘成熟叶片的3种主效成分含量均显著高于野生樟叶越橘（P<0.05），组培樟叶越橘的CA、绿原酸和熊果苷含量分别是野生樟叶越橘2.55倍、2.84倍、2.27倍。叶芽中CA和熊果苷含量也表现为组培樟叶越橘显著高于野生樟叶越橘，组培樟叶越橘CA和熊果苷含量分别是野生樟叶越橘1.30倍、1.23倍;组培和野生樟叶越橘叶芽中绿原酸含量则没有显著性差异。组培樟叶越橘花芽中3种主效成分含量显著低于野生樟叶越橘，组培樟叶越橘的CA、绿原酸和熊果苷含量只有野生樟叶越橘的69.77%、76.70%和70.31%。说明组培与野生樟叶越橘的不同组织部位中3种主效成分含量存在较大的差异，组培樟叶越橘的成熟叶片和叶芽组织的主效成分含量高于野生樟叶越橘（叶芽组织的绿原酸含量除外），而野生樟叶越橘花芽组织的主效成分含量却高于组培樟叶越橘。

由图1可知，3种主效成分含量在组培和野生樟叶越橘不同组织中均表现为CA>绿原酸>熊果苷，且差异达到极显著水平（P<0.01）。但同一成分的组织含量分布特征在组培和野生樟叶越橘中

存在差异（表2）。组培樟叶越橘中，叶芽（LB-SWFU）的CA含量显著高于成熟叶片（ML-SWFU）和花芽（FB-SWFU），后2种组织中则无显著差异;绿原酸在成熟叶片（ML-SWFU）中的含量显著高于叶芽（LB-SWFU）和花芽（FB-SWFU），后2种组织差异显著;熊果苷在叶芽（LB-SWFU）中的含量显著高于花芽（FB-SWFU），后者又显著高于成熟叶片（ML-SWFU）。而野生植物中CA、绿原酸和熊果苷在组织含量分布上均表现为花芽（FB-XC）>叶芽（LB-XC）>成熟叶片（ML-XC），且差异显著（表2）。

2.3 不同种源樟叶越橘成熟叶片中主效成分含量比较

通过以上对组培与野生樟叶越橘不同部位中主效成分含量比较发现，组培樟叶越橘成熟叶片中3种主效成分含量较高，且显著高于野生樟叶越橘成熟叶片。植物叶片资源量远远大于叶芽和花芽，因此，本研究继续比较了不同种源樟叶越橘（包括1个组培樟叶越橘试样和3个不同地点的野生植物试样）成熟叶片中3种主效成分含量（表3）。由表3可知，不同样品中CA和绿原酸含量高低顺序分别为ML-SWFU>ML-YQ>ML-HP>ML-XC和ML-SWFU>ML-YQ>ML-XC>ML-HP，熊果苷含量表现为ML-YQ>ML-HP>ML-SWFU>ML-XC，均差异显著。各主效成分在不同种源樟叶越橘成熟叶片中的含量均存在显著差异;组培樟叶越橘成熟叶片中CA和绿原酸含量均显著高于野生樟叶越橘，熊果苷的含量处于不同种源野生樟叶越橘的中间水平。另外，不同种源樟叶越橘成熟叶片中3种主效成分含量均符合CA>绿原酸> 熊果苷的规律（图2）。表明组培樟叶越橘成熟叶片中富集的主效成分含量能够达到甚至超过野生樟叶越橘的水平。

3 讨论与结论

富含CA、绿原酸和熊果苷3种主效成分的新兴、健康特殊民族资源植物樟叶越橘已被报道具有重要的药用[23-26]和经济[5-9，27]价值，随着对其开发利用的研究增多，其野生资源也日益紧张。植物组织培养技术可在不破坏野生资源的前提下为研究者带来大量无性繁殖植物，且具有不受地理、季节和气候等条件限制的优势[28]。在已经开展樟叶越橘组培体系建立[17]和培育获得组培樟叶越橘[18]的研究下，本试验比较了组培与野生樟叶越橘不同组织部位中3种主效成分含量，结果表明，组培樟叶越橘在成熟叶片和叶芽组织中具有高于野生樟叶越橘的主效成分含量，尤其是CA和绿原酸在组培樟叶越橘成熟叶片中的含量均显著高于野生樟叶越橘。CA和绿原酸是野生樟叶越橘中含量最高的2种主效成分[5，29]。因此，组培樟叶越橘不仅解决了野生植物取材困难、资源匮乏等问题，还具备了替代野生植物可大量提取获得主效成分的潜能。

已知文獻报道，野生樟叶越橘3种主效成分含量高低顺序在各组织中均表现为CA>绿原酸>熊果苷[21，29]。本研究中组培和不同种源野生樟叶越橘各组织中也呈现同样的规律，但3种主效成分的组织含量分布特征在组培和野生樟叶越橘中存在较大差异。本研究中，CA、绿原酸和熊果苷在野生樟叶越橘组织含量分布上均表现为花芽>叶芽>成熟叶片，这不同于以往文献显示的叶芽>花芽>成熟叶片的结果报道[21，29]，且化合物具体含量值也存在较大差异，推测这可能与植物样品种源[30-34]和干燥方式[35-38]、化合物提取工艺和检测方式[22，39-41]等因素不同有关。组培樟叶越橘中，熊果苷的组织含量分布与文献[21，29]报道的一致，为叶芽>花芽>成熟叶片;而CA和绿原酸的组织含量分布特征则不同于以上规律，CA在叶芽中的含量显著高于成熟叶片和花芽的，后两者无显著差异;绿原酸在成熟叶片中的含量显著高于叶芽和花芽，后两者也无显著差异。随着CA、绿原酸、熊果苷等化合物的需求范围不断扩大，对其不仅有高含量提取的要求，而且提取工艺和检测方法等既要节约资源，又要准确简便。因此，建立樟叶越橘主效成分含量提取鉴定方式的统一标准是后期研究努力的一个方向。

综上所述，樟叶越橘CA、绿原酸、熊果苷3种主效成分含量因种源和组织部位不同而存在差异。在成熟叶片和叶芽组织中，组培樟叶越橘的成熟叶片和叶芽组织的主效成分含量高于野生樟叶越橘（叶芽组织的绿原酸含量除外）。不同种源樟叶越橘成熟叶片中各主效成分含量差异显著，组培樟叶越橘的CA和绿原酸含量均显著高于野生樟叶越橘。因此，可通过规模化繁育樟叶越橘组培樟叶越橘替代其野生植物大量提取主效成分，从而解决樟叶越橘在开发利用过程中存在的野生资源匮乏和取材困难等问题。

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