林江波，王伟英，邹 晖，戴艺民

(福建省农业科学院 亚热带农业研究所，福建漳州 363005)

植物甾醇是一类甾体类植物天然活性物质，具有延缓衰老[1]、抗氧化[2]和抗肿瘤[3]等功效。植物甾醇根据侧链C-24位上烷基的有无分为无烷基甾醇、甲基甾醇和乙基甾醇，菜油甾醇和菜籽甾醇属于甲基甾醇，豆甾醇和β-谷甾醇属于乙基甾醇[4-5]。周海玥等[6]研究发现，豆甾醇和β-谷甾醇具有改善非酒精性脂肪肝肝细胞脂肪变性程度及减轻氧化应激反应的作用；张硕等[7]研究发现白花蛇舌草豆甾醇具有抑制肝癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡的作用；周玲玉等[8]研究发现β-谷甾醇可以诱导人肺癌A549细胞G2/M期细胞周期阻滞，引起癌细胞凋亡。甾醇C-24甲基转移酶2(SMT2)催化24-亚甲基胆甾烯醇合成24-亚乙基胆甾烯醇[9-10]，是乙基甾醇合成关键酶，开展SMT2基因功能研究对研究植物甾醇的代谢和调控具有重要意义。目前，已经从多种植物中克隆到SMT2基因[11-13]，但是开展SMT2基因功能研究的还少有报道。

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)是兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw.)的名贵中药材，位列“中华九大仙草”之首，其功效成分主要有多糖、石斛碱、黄酮和甾醇类等[14-18]，具有提高免疫力和抗肿瘤等生理活性[19-22]。本课题组基于对铁皮石斛茎和叶的转录组测序，分析了铁皮石斛植物甾醇的代谢途径，分3个阶段，50个unigenes (30种酶)参与，铁皮石斛甾醇C-24甲基转移酶2基因(DoSMT2)在叶的表达量高于茎，生长期高于成熟期[23]；克隆了铁皮石斛DoSMT2基因的全长cDNA序列，生物信息学分析结果表明DoSMT2蛋白属于AdoMet-MTases超级家族，含有4个S-腺苷蛋氨酸结合位点、1个甲基转移酶保守结构域和1个甾醇甲基转移酶C末端保守结构域，与深圳拟兰(Apostasiashenzhenica)的SMT2亲缘关系最近[24]。本研究构建了DoSMT2基因正义植物表达载体，利用农杆菌介导遗传转化烟草，分析DoSMT2基因功能，以期为进一步了解铁皮石斛植物甾醇代谢机理奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

大肠杆菌(Esherichiacoli) DH5α菌株、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105菌株、PcxSN植物表达载体和烟草(Nicotianatabacum)NC89无菌试管苗由本实验室保存。

XcmⅠ购自NEB公司，2×Accurate TaqMaster Mix (dye plus)、SteadyPure植物RNA提取试剂盒和SYBR GreenProTaqHS 预混型qPCR试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DNA Ligation Kit Ver.2.1和PrimeScriptTM逆转录酶购自宝生物工程(大连)有限公司；头孢噻肟钠(cefotaxime sodium)、特泯菌(timentin)、乙酰丁香酮(acetosyringone)、潮霉素 B 溶液(hygromycin B solution)、DNA胶回收试剂盒、UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。菜油甾醇(Lot B0408AS)和谷甾醇(Lot N0615AS)标准品购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1DoSMT2基因开放阅读框的克隆以重组的克隆载体质粒pMD19-T-DoSMT2[24]为模板，利用引物SMT-F和SMT-R(表1)扩增DoSMT2基因的开放阅读框。PCR扩增体系50 μL：质粒pMD19-T-DoSMT2 1 μL，引物(10 mmol·L-1)各1 μL，2×Accurate TaqMaster Mix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳验证后，胶回收目的片段。

1.2.2 植物表达载体的构建植物表达载体pCXSN经XcmⅠ酶切，酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳验证后，胶回收载体片段。回收产物与DoSMT2基因的胶回收产物在16 ℃连接2 h，连接体系10 μL：pCXSN酶切回收产物2 μL、DoSMT2基因胶回收产物3 μL、Solution I 5 μL。连接产物转化大肠肝菌DH5α感受态细胞后，在105 r·min-1、37 ℃条件下振荡培养1 h后，菌液涂布于含卡那霉素100 mg·L-1的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养过夜。挑取单克隆在含卡那霉素100 mg·L-1的液体LB培养基中，37 ℃条件下200 r·min-1振荡培养过夜。提取经PCR鉴定为阳性克隆的质粒，委托生工生物工程(上海)有限公司测序，通过序列比对获得重组的正义植物表达载体质粒pCXSN-DoSMT2(图1)。

图1 植物表达载体pCXSN-DoSMT2的构建Fig.1 Construction of plant expression vector pCXSN-DoSMT2

1.2.3 农杆菌介导重组质粒pCXSN-DoSMT2遗传转化烟草采用“冻融法”将重组正义植物表达载体质粒pCXSN-DoSMT2导入农杆菌EHA105中。利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法[25]，将pCXSN-DoSMT2基因遗传转化烟草，获得抗潮霉素的抗性转化植株。烟草转化植株种植于温室大棚。

1.2.4 转基因烟草的分子检测以CTAB法提取的烟草抗性转化植株叶片基因组DNA为模板，用引物Hpt1和Hpt2进行PCR扩增潮霉素基因片段，筛选抗性转化植株，产物长度为517 bp。用引物SMTBolt-F和SMTBolt-R进行 PCR法制备地高辛标记探针，经PCR检测为阳性的烟草植株基因组DNA用Hind Ⅲ酶切后用于Southern blot。Southern blot委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

用SteadyPure植物RNA提取试剂盒提取转DoSMT2基因烟草叶片总RNA，用PrimeScriptTM逆转录酶合成cDNA第1链。将合成的cDNA第1链浓度定量为200 ng·μL-1，以烟草Actin基因作为内参基因，根据SYBR GreenProTaqHS 预混型qPCR试剂盒的说明书进行实时荧光定量PCR扩增(Roche LightCycler 96)，检测外源DoSMT2基因在不同转基因烟草中的表达情况。DoSMT2基因引物为SMT2-F和SMT2-R，烟草Actin基因引物为NtACT-F和NtACT-R。

1.2.5 转基因烟草植物甾醇含量测定转基因烟草叶片菜油甾醇和谷甾醇的含量委托青岛科创质量检测有限公司测定，参考李涛等[26]的方法。

1)样品前处理 取0.5 g转基因烟草叶片粉末，于取样瓶中，以非转基因烟草叶片为对照，加入5 mL二氯甲烷，超声波萃取20 min，6 000 r·min-1离心5 min，分离取出二氯甲烷，再加入5 mL二氯甲烷超声波萃取10 min，离心分离取出二氯甲烷，合并2次萃取液，用二氯甲烷定容至10 mL，过0.45 μm滤膜后，进样分析。

2)色谱条件 Thermo TG-5 MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样量2 μL；升温程序：80 ℃保持2 min，以20 ℃·min-1的速率升温至300 ℃，保持15 min；进样口温度为300 ℃；载气为He，载气流速为0.8 mL·min-1；分流比为40∶1。

3)质谱条件 离子源温度200 ℃，传输线温度250 ℃，溶剂延迟时间3.00 min，扫描范围30～450 m/z，离子源为EI源70 eV。

1.3 数据处理

方差分析采用DPS软件[27]，差异显著性用最小显著差数法(LSD)进行平均数的多重比较。

2 结果与分析

2.1 DoSMT2基因开放阅读框克隆

以重组克隆载体质粒pMD19-T-DoSMT2为模板，利用引物SMT-F和SMT-R扩增DoSMT2基因的开放阅读框，扩增产物在1 119 bp处有1条特异性条带(图2)，胶回收目的条带，获得DoSMT2基因的开放阅读框。

2.2 植物表达载体的构建与鉴定

胶回收XcmⅠ酶切后植物表达载体pCXSN片段，与DoSMT2基因胶回收产物连接后转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆于含有100 mg·L-1卡那霉素的液体LB培养基扩繁，经菌液PCR鉴定(图3)后，提取阳性克隆菌株的质粒并进行测序，通过序列比对分析，获得正义植物表达载体质粒pCXSN-DoSMT2。

2.3 转基因烟草基因组DNA的PCR检测

利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法将重组正义植物表达载体pCXSN-DoSMT2遗传转化烟草，通过潮霉素抗性筛选，共获得6株抗潮霉素烟草植株。提取6株抗潮霉素烟草植株基因组DNA，以Hpt1和Hpt2作为引物，PCR扩增潮霉素基因片段。其中4株能扩增到1条517 bp特异条带(图4)，分别用代号P1、P2、P3和P4表示。以4株能扩增到潮霉素基因片段的烟草植株基因组DNA为模板，以SMT-F和SMT-R为引物，扩增DoSMT2基因，4株转基因烟草植株在1 119 bp处能扩增出1条特异条带(图5)，而非转基因植株没有该条带，说明外源DoSMT2基因已经整合到烟草基因组中。

M.DL2000;1-2.DoSMT2图2 DoSMT2基因开放阅读框PCR产物电泳Fig.2 PCR product electrophoresis of DoSMT2 gene ORF

M.DL2000;1、3、4.DoSMT2;2、5.阴性克隆图3 重组质粒pCXSN-DoSMT2的PCR检测M.DL2000;1,3,4.DoSMT2;2,5.Negative cloneFig.3 PCR detection of recombinant plasmid pCXSN-DoSMT2

2.4 转DoSMT2基因烟草基因组DNA的Southern blot检测

经过潮霉素基因和DoSMT2基因的PCR检测为阳性的4株转基因烟草植株和非转基因烟草植株的基因组DNA用Hind Ⅲ酶切，以DIG标记的DoSMT2基因为探针进行Southern杂交，以pMD19-T-DoSMT2为阳性对照。结果表明，4株转基因烟草植株都有1条杂交信号带，非转基因烟草植株没有杂交信号带(图6)，说明外源DoSMT2基因都以单拷贝整合到4株转基因烟草基因组中。

M.DL2000;1-6.潮霉素抗性植株图4 潮霉素基因片段的PCR检测M.DL2000;1-6.Hygromycin resistant plantletFig.4 PCR detection of hygromycin gene fragment

M.DL2000;P1-P4.潮霉素抗性植株;CK-.非转基因植株;CK+.pMD19-T-DoSMT2图5 DoSMT2基因的PCR检测M.DL2000;P1-P4.Hygromycin resistant tobacco;CK-.Non-transgenic tobacco;CK+.pMD19-T-DoSMT2Fig.5 PCR detection of DoSMT2 gene

M.DNA 分子量标记Ⅱ;P1-P4.转基因烟草植株;CK-.非转基因烟草植株;CK+.pMD19-T-DoSMT2图6 转DoSMT2基因烟草植株的Southern blot杂交结果M.DNA molecular-weight marker Ⅱ;P1-P4.Transgenic tobacco;CK-.Non-transgenic tobacco;CK+.pMD19-T-DoSMT2Fig.6 Southern blot of transgenic tobacco with DoSMT2 gene

CK.非转基因烟草;P1-P4.转基因烟草;柱上不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同图7 DoSMT2基因在转基因烟草叶片中的表达分析CK.Non-transgenic tobacco;P1-P4.Transgenic tobacco;Different capital letters upon column indicate significant difference at 0.01 level.The same as belowFig.7 Expression of DoSMT2 gene in leaves of transgenic tobacco

2.5 转基因烟草DoSMT2基因表达分析

以烟草Actin基因为内参基因，利用qRT-PCR技术检测DoSMT2基因在4株转基因烟草叶片中的表达情况。结果表明(图7)，非转基因烟草未检测到外源DoSMT2基因表达，4株转基因烟草都能检测到DoSMT2基因的表达，表达水平差异达到极显著。其中表达量最高的是P3株，其次是P1株，P2和P4株的表达差异不显著。

2.6 转基因烟草叶片菜油甾醇和谷甾醇含量测定

对4株转DoSMT2基因烟草叶片菜油甾醇和谷甾醇的含量进行测定，结果表明(图8)，4株转DoSMT2基因烟草叶片的菜油甾醇含量极显著低于非转基因烟草叶片，其中P1、P3和P4之间差异不显著，但极显著低于P2；4株转DoSMT2基因烟草叶片的谷甾醇的含量都极显著高于非转基因烟草叶片，且4株之间也都存在极显著差异，含量从高到低依次为P3>P1>P4>P2。

图8 转基因烟草叶片菜油甾醇和谷甾醇含量Fig.8 Contents of campesterol and sitosterol in transgenic tobacco leaves

3 讨 论

植物甾醇是生物膜的组成成分，具有调节膜流动性和渗透性的作用。甾醇C-24甲基转移酶(sterol C-24-methyltransferase;SMT)分为SMT1和SMT2两个家族。SMT1催化C-24位的第一次甲基化，完成甲基从S-腺苷甲硫氨酸到环阿屯醇的转移，形成C-24甲烯基环阿屯醇，SMT2催化C-24位的第二次甲基化，形成24-亚乙基胆甾烯醇[28]。

SMT2位于植物甾醇合成途径中甲基甾醇和乙基甾醇的一个分支点。已有研究结果表明，以CaMV 35S或TET1作为组成型启动子，利用根癌农杆菌把拟南芥SMT2基因转化烟草，对转基因烟草叶片甾醇测定发现，菜油甾醇的含量下降，同时谷甾醇的含量增加，其他甲基甾醇、乙基甾醇和总甾醇含量与对照差异不大，说明SMT2基因主要调节植物细胞中甲基甾醇菜油甾醇和乙基甾醇谷甾醇的含量和比例，不改变植物细胞中总甾醇的含量[29-31]。因此，通过检测转基因植株中菜油甾醇和谷甾醇含量的变化，可以验证SMT2基因的功能。本研究以CaMV 35S作为组成型启动子，通过根癌农杆菌介导，把DoSMT2基因遗传转化烟草，经过基因组水平检测，获得了4株在组成型启动子CaMV 35S控制下的转DoSMT2基因烟草植株。qRT-PCR技术检测表明，DoSMT2基因在4株转基因烟草叶片中都有表达，且表达量存在极显著的差异。通过分析转基因烟草叶片菜油甾醇和谷甾醇的含量发现，DoSMT2基因在烟草叶片中的表达量与菜油甾醇含量呈负相关，与谷甾醇含量呈正相关。转基因烟草植株叶片菜油甾醇含量是非转基因烟草的0.62～0.79倍，极显著降低，谷甾醇含量是非转基因烟草的1.54～2.22倍，极显著升高。

综上所述，DoSMT2具有催化24-亚甲基胆甾烯醇合成24-亚乙基胆甾烯醇的酶活性。本研究结果为后续调控铁皮石斛植物甾醇生物合成及开发利用铁皮石斛叶片植物甾醇打下了基础。