杜贞娜，晏子英，候忠余，李树江，张晓勇，杨友联

(六盘水师范学院 生物科学与技术学院，贵州 六盘水 553004)

【研究意义】猕猴桃(Actinidiaspp.)是一种经济价值极高的水果，其中Vc含量非常丰富，每100 g果肉中含有Vc 100～420 mg，被誉为“水果之王”[1-5]。近年来，由于猕猴桃栽培面积不断扩大和猕猴桃产业的发展，猕猴桃溃疡病(Kiwifruitbacterialcanker)已成为影响猕猴桃产业发展中最具毁灭性的病害[5-10]。【前人研究进展】关于猕猴桃溃疡病的病原菌存在较多争议，Opgenorth等[11]将该病原菌定为丁香假单胞杆菌死李致病变种(Pseudomonassyringaepv.morsprunorum)；而日本、意大利等国家的学者根据病害在当地的寄主范围和发病症状以及病原菌的物理和化学特性认为，致病病原为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，PSA)[12-13]，该结论得到学术界的普遍认可[10，14-19]。【本研究切入点】目前，猕猴桃溃疡病病原菌的鉴定和生防菌的筛选已有研究报道[10，17，19-28]，但是该病的生物防治仍处于起步阶段。【拟解决的关键问题】从猕猴桃感染溃疡病的染病组织分离致病病原菌，从猕猴桃种植土壤和健康猕猴桃组织中分离细菌，采用抑菌圈法筛选猕猴桃溃疡病拮抗菌株，在此基础上采用形态学与分子生物学相结合进行鉴定，以期探明猕猴桃溃疡病的致病病原并为该病的生物防治提供有效的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 猕猴桃 于2017年3月中旬猕猴桃溃疡病高发期，在六盘水猕猴桃主产区米萝百里猕猴桃产业带采集具有典型猕猴桃溃疡病的树枝和主干韧皮部及分泌物，每株发病植株用解剖刀切取发病部位长约10 cm，宽约3 cm的发病组织2块，共20个样品，装于自封袋带回实验室于4 ℃冰箱保存、备用；于2018年4月在六盘水猕猴桃主产区米萝百里猕猴桃产业带采集健康的猕猴桃根组织，每株采集3条健康的根，共4株植物12条约长10 cm的根，将样品带回实验室于4 ℃冰箱保存、备用。

1.1.2 土壤 2018年4月采自六盘水猕猴桃主产区米萝百里猕猴桃产业带猕猴桃园。铲弃5～10 cm表土层，挖取约300 g土样装于信封内，带回实验室于4 ℃冰箱保存、备用。

1.1.3 试剂 基因组 DNA 提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司生产；16S rRNA 通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)；KN-F(5’-CACGA TACATGGGCTTATGC-3’)，KN-R(5’-CTTTTCATCCACACACTCCG-3’)，AvrDdpx-F(5’-TTTCGGTGGTAACGTTGGCA-3’)，AvrDdpx-R(5’-TTCCGCTAGGTGAAAAATGGG-3’)。引物均委托成都栢晖生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与鉴定 ①分离纯化。取病健交界处的病组织切成约4 mm×4 mm大小的方形小块，于75 %乙醇溶液中浸泡1 min后用无菌水冲洗3次，再将其置于加有10 mL无菌水的培养皿中，用无菌剪刀将病组织充分剪碎后静置1 h。吸取菌悬液150 μl涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，于25 ℃恒温倒置培养48 h。挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线培养，经多次重复纯化后转至牛肉膏蛋白胨斜面4 ℃保存备用。②形态学鉴定。将分离纯化的病原菌涂布在牛肉膏蛋白胨平板，25 ℃恒温培养18 h后，观察菌落特征并进行革兰氏染色和鞭毛染色。③分子生物学鉴定。采用DNA提取试剂盒提取病原菌基因组DNA；利用细菌 16S rRNA 通用引物27f和1492r对各供试菌株DNA进行 PCR 扩增。PCR反应体系为25 μl：12.5 μl 2×TaqPCR Mastermix，27f和1492r各1 μl，模板DNA 2 μl，加ddH2O补至25 μl。PCR反应程序为95 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；最后72 ℃延伸7 min。扩增完成后，将得到的PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测后送至成都栢晖生物科技有限公司测序。④病原菌株双重PCR特异性检测。参照TU等[26]的方法，采用特异性双重引物(KN-F、KN-R、AvrDdpx- F和AvrDdpx-R)对病原菌株进行双重PCR特异性检测。双重PCR扩增体系为25 μl：12.5 μl 2×TaqPCR mastermix，AvrDdpx-F/AvrDdpx-R和KN-F/KN-R各1 μl，模板DNA 4 μl，加ddH2O补至25 μl。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测。⑤序列分析及系统进化树构建。将目标菌株序列的测序结果在 GenBank 数据库中与已知序列进行BLAST比对，并查阅相偶联的文献后下载相关序列[29]，采用 Clustal X进行比对[30]。为达到排序匹配的最优化，用Bioedit 5.0.6手工校正。校对后的序列采用 PAUP 4.0 beta 10 以最大简约法(Maximum parsimony，MP)进行分析，以启发式搜索(Heuristic Search)获取系统发育树。系统发育树各个分枝的支持强度通过1000次重复自展检验数值进行评估[31]。

1.2.2 病原菌的致病性检测 将新鲜健康的猕猴桃的离体枝条(长10 cm)插于清水中接种时，先用蒸馏水冲洗干净，再用70 %酒精对枝条表面消毒1 min，然后用1号昆虫针蘸取细菌悬液(1×109cfu/mL)针刺接种。每个菌株接4根枝条，每根枝条接2个接种点，以无菌水作对照。接种后套袋保湿于与15 ℃下，逐日观察发病情况。待发病后，从发病组织进行病原菌再分离。

1.2.3 生防菌的分离、筛选及初步鉴定 ①分离纯化。采用土壤稀释分离法分离土壤样品中的细菌。称取5 g研细的土壤样品，加入盛有45 mL无菌水三角瓶中充分摇匀，取1 mL上清液加入9 mL无菌水混匀。将其依次稀释至10-3、10-4和10-5，各取0.1 mL稀释液涂布牛肉膏蛋白胨培养平板，3个重复，于28 ℃下培养24～72 h，挑选不同类型的单菌落纯化后于4 ℃冰箱保存备用。猕猴桃内生菌的分离采用常规组织分离法。将猕猴桃组织表面消毒、剪碎后接种到牛肉膏蛋白胨平板上，倒置于30 ℃恒温培养24～48 h后，将不同形态的单菌落转接到牛肉膏蛋白胨平板，纯化后编号，于4 ℃环境中保存备用。②生防菌的筛选。将纯化保存的细菌活化后用多点接种法接种于牛肉膏蛋白胨平板上，于28 ℃培养6 h，将培养16 h的猕猴桃溃疡病病原菌稀释10-3倍后喷雾接种至该平板上，培养72 h后观察有无抑菌圈及抑菌圈大小，筛选出有明显抑制作用的拮抗菌株。③生防菌的初步鉴定。生防菌形态学和分子生物学鉴定同1.2.1。

2 结果与分析

2.1 病原菌

2.1.1 病原菌的形态学特征 从采集到的猕猴桃溃疡病典型病样中共分离到9株病原菌菌株。从图1可见，平板上菌落呈圆形，略微隆起，污白色，边缘全缘，表面光滑，半透明；菌体杆状，少数稍弯曲，大小为(1.2～2.1)μm×(0.4～0.6)μm，无芽孢，革兰氏染色呈红色；多数极生1根鞭毛，少数为2～3根。

2.1.2 病原菌的分子鉴定及序列分析 ①病原菌双重 PCR 特异性检测。从图2可见，分离菌株LPSU-B201702、LPSU-B201707、LPSU-B2017012、LPSU-B201713、LPSU-B2017011、LPSU-B201710、LPSU-B201709、LPSU-B201705和LPSU-B201703在290 和492 bp 左右的位置均检测到2条扩增片段。②病原菌16S rRNA 序列分析及系统树的构建。将分离菌株的基因组 DNA 作为模板，应用16S rRNA通用引物27f/1492r 进行 PCR 扩增，9株菌均获得片段长度约1500 bp的目的条带。将测序结果在GenBank上进行同源性检索，下载同源性、可信度高的菌株(表1)参与分析，以Bacillusamyloliquefaciens(菌株号：GZYCT-9)为外内群构建系统树。

从图3看出，分离菌株与丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringae pv.actinidiae)、榛色假单胞菌(P.avellanae)、丁香假单胞杆菌番茄致病变种(P. pv.tomato)、丁香假单胞杆菌茶致病变种(P. pv.theae)聚为1个大进化支，支持率为89 %。其中，菌株LPSU-B2017013、LPSU-B201707、LPSU-B201709和LPSU-B201710与来自新西兰的NZ-47、ICMP 18884及来自葡萄牙的CRAFRU 14.08菌株聚为1个独立亚进化分支，支持率为59 %，支内无支长差异；菌株LPSU-B201711、LPSU-B201705、LPSU-B201702、LPSU-B201712和LPSU-B201703与菌株IKB4、PSA835、tz5、BC7、FJ-21d、KIWI-GengYuhe、M227、IHL1及18YN-PSA-C2聚为另1个亚进化支，支持率低于50 %。

2.1.3 分离菌株的致病性 分离菌株接种到猕猴桃枝条上 7 d 后开始显示症状，即在枝干接种点开始出现乳白色菌脓溢出，随后颜色变浅黄色，最后变成锈红色；感病部位韧皮部细胞坏死，组织褐变。对照(无菌水)接种处理未见症状。

2.2 生防菌

2.2.1 分离及筛选 根据菌落的颜色、形态及边缘等培养特征初步确定从土壤和猕猴桃根组织共分离得到35株细菌，其中，土壤20株，猕猴桃内生菌15株。从图4看出，采用抑菌圈法筛选出的LPSU20180610011、LPSU20180610010和LPSU20180610031菌株对猕猴桃溃疡病病原菌具有一定的拮抗效果。其中，分离自猕猴桃根的菌株LPSU20180610011和LPSU20180610010的抑菌圈大小分别为17.5～25.0和15.0～23.5 mm，平均分别为20.8和20.9 mm；分离自土壤的菌株LPSU20180610031的抑菌圈为19.5～27.5 mm，平均为23.7 mm(表2)。

表1 参与构建基因系统树的菌株信息

2.2.2 病原菌的鉴定 革兰氏染色和芽孢染色表明，3个菌株均为革兰氏阳性菌，具芽孢。其中，菌株LPSU20180610010大小为(2.31～3.86)μm×(0.71～1.27)μm，平均为(3.04±0.18)μm×(0.91±0.03)μm，n=20；菌株LPSU20180610011大小为(2.35～3.90)μm×(0.77～1.26)μm，平均为(3.35±0.21)μm×(0.95±0.02)μm，n=20；菌株LPSU20180610031大小为(1.12～2.23)μm×(0.53～0.81)μm，平均为(1.63±0.09)μm×(0.67±0.01)μm，n=20。将3株生防菌的16S rRNA序列在GenBank中比对的结果表明，LPSU20180610010和LPSU20180610011与Bacilluscereus、B.thuringiensis及B.oryzaecorticis的相似度达100 %；LPSU20180610031与B.safensis、B.aerius、B.altitudinis及B.pumilus的相似度达100 %。结合形态学及16S rRNA分析，筛选出的3株生防菌均属芽孢杆菌属(Bacillus)，其中，LPSU20180610010和 LPSU20180610011序列完全相同，可能为该属同1个种。

3 讨 论

猕猴桃溃疡病是猕猴桃栽培区频繁发生、危害严重的毁灭性植物病害，现已被列为中国森林植物检疫对象[32]。国内外对猕猴桃溃疡病病原菌有很多研究报道，主要集中在病原菌特点、分类地位、病原菌分离和鉴定及发病传播规律等方面[5-6，9-10，33-40]。该研究从六盘水市猕猴桃产区染病猕猴桃枝条中分离到的病原菌经形态特征、染色反应、双重 PCR 特异性检测和16S rRNA序列分析等方法鉴定表明，其与国内外报道的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种为同1个种。形态学、染色反应及16S rRNA序列鉴定均不能准确鉴定，在16S rRNA序列构建的系统树中，分离菌株与丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种、榛色假单胞菌、丁香假单胞杆菌番茄致病变种和丁香假单胞杆菌茶致病变种聚为1个大进化支，支内亚分支支持率较低，与亲缘关系较近的榛色假单胞菌等较难分开。在双重PCR检测中出现2条特异性检测条带的均为猕猴桃溃疡病病原菌，充分证实了双重PCR检测的准确性[29]。为快速有效防治该病，建议可直接采用双重PCR进行检测后采取防治措施，以减少损失。

表2 拮抗菌对猕猴桃溃疡病病原菌的抑菌圈直径

菌株LPSU-B201713、LPSU-B201707、LPSU-B201709和LPSU-B201710与来自新西兰的NZ-47、ICMP 18884和来自葡萄牙的CRAFRU 14.08菌株16S rRNA序列完全相同；菌株LPSU-B201702、LPSU-B201705、LPSU-B201703、LPSU-B201711和LPSU-B201712和来自我国云南的18YN-PSA-C2、浙江的tz5、福建的FJ-21d、陕西的KIWI-Geng Yuhe和M227以及新疆的YL5-2菌株遗传关系最近，其中LPSU-B201705、LPSU-B201711和LPSU-B201712菌株的16S rRNA序列与以上国内6省分离菌株的完全相同，LPSU-B201702菌株与有1个碱基差异，表明菌株之间有一定的遗传差异。

通过抑菌圈法筛选生防菌株表明，LPSU20180610011、LPSU20180610010和LPSU20180610031菌株有较好的抑菌效果。根据3株菌株均为杆状，具有芽孢，结合16S rRNA序列分析，3株菌均为芽孢杆菌属细菌(Bacillusspp.)；根据菌落特征、显微形态及大小以及16S rRNA分析，LPSU20180610010和LPSU20180610011菌株为同1个种。盛存波等[25]从猕猴桃根际土壤中筛选出芽孢杆菌B56-3菌株对猕猴桃溃疡病有较好的防治效果。郭睿文[41]从猕猴桃植株中分离筛选出6株对猕猴桃溃疡病有较稳定拮抗作用的细菌，并鉴定出6株菌株分别主要属假单胞菌属(Pseudomonassp.)和梭形芽孢杆菌属(Lysinibacillussp.)。

该研究分离筛选的生防菌株生物学特性以及田间防效等有待于进一步深入研究。

4 结 论

该研究从六盘水市猕猴桃产区染病猕猴桃枝条中分离到9株病原菌，经鉴定，其与国内外报道的丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种为同1个种。从土壤和猕猴桃根组织分离得到3株细菌LPSU20180610011、LPSU20180610010和LPSU20180610031均对猕猴桃溃疡病病原菌具有一定的拮抗效果，初步鉴定均为芽孢杆菌属细菌。