张晔，胡艳红，柯发杰，陈胜，陈子扬，胡俊

随着科技水平及生活水平的不断提高，糖尿病的发病率逐年提升，预计到2040年，全球糖尿病患者将达到6.42亿[1]。作为糖尿病致盲病中的第二大并发症糖尿病性白内障，其治疗仍以眼科手术为主。但如果是老年人和高血糖情况下更易发生如感染、角膜水肿和眼压增高等诸多术后并发症，且有些人因自身其他原因不能手术。近年来研究糖尿病性白内障的发病机制已成为眼科领域的热点，其中氧化损伤无疑是研究的热门[2-3]，而氧化应激与丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路的ERK、Raf等活化密切相关[4-5]。铁皮石斛中的活性成分铁皮石斛多糖（dendrobium officinale polysaccharide，DOP）有抗氧化、降血糖、抗细胞凋亡、抗肿瘤等作用[6]。本研究应用链脲菌素（streptozocin，STZ）建立糖尿病大鼠模型，检测DOP对糖尿病性白内障大鼠血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧歧化物酶（superoxide dismutase，SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力的变化，晶状体ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras mRNA的表达水平，以明确DOP对糖尿病性白内障大鼠抗氧化作用的影响及其可能的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级Wistar雄性大鼠50只，体重（180±20）g（福建省中医药研究院提供，许可证号：SCXK (闽)2012-0001），实验动物条件符合《实验动物管理条例》 要求。实验动物饲养于湿度60%±10%和温度（25±1）℃的环境中。实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》的要求，并经福建省中医药研究院动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器

DOP（批号:S20181201，纯度≥85%）和STZ（批号:Sigma8050-20180601，纯度≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；MDA试剂盒（批号:20181012），SOD试剂盒（批号:20181112）和GSH-Px试剂盒（批号:20191102）均购自福州安布瑞生物科技有限公司；荧光定量PCR仪（美国ABI，7300）。

1.3 分组与建模

50只Wistar大鼠，经裂隙灯显微镜检查所有大鼠双眼晶状体均透明。随机分5组，对照组（control group，CG）、模型组（model group，MG）、铁皮石斛多糖低（DOP low dose，DOPL）、中（DOP medium dose，DOPM）、高（DOP high dose，DOPH）剂量组，每组10只。模型组与DOP组大鼠建立糖尿病模型，4组大鼠均给予禁食不禁水12 h以上，按50 mg·kg-1体质量腹腔注射用柠檬酸缓冲液配制的10 g·L-1的STZ，对照组注射等量的柠檬酸缓冲液。注射2 h后喂食，72 h后取尾血测随机血糖，血糖≥11.1 mmol/L者为糖尿病模型造模成功，取血糖值11.1～16.7mmol/L大鼠进行实验。分别在造模前、后对所有大鼠进行裂隙灯检查晶状体透明度，晶状体混浊者为糖尿病性白内障。

DOPL、DOPM、DOPH组分别给予DOP 25、50和100 mg·kg-1灌胃，对照组（CG）、模型组（MG）按相同容量生理盐水灌胃，每日2次，时间为上午9点和下午3点，以维持一定的血药浓度，且灌胃前后2 h禁止饮食，其余时间正常喂养。共用药12周。

12周后处死大鼠，摘除眼球，在显微镜下后入路剪除眼球后壁，完整分离出晶状体组织，用生理盐水漂洗后液氮速冻，于-80℃冰箱中保存备用，每组10个样本进行检测。

1.4 晶状体混浊程度评定

12周后在裂隙灯下观察晶状体，并使用晶状体混浊分类系统（lens opacities classification system II，LOCS II）方法评定晶状体混浊程度[7]。评定标准如下：C0，皮质透明；Ctr，皮质少量点状混浊；C1，皮质点状混浊扩大，瞳孔区内出现少量点状混浊；C2，皮质车轮混浊，超过两个象限；C3，皮质车轮状混浊扩大，瞳孔区约50%混浊；C4，瞳孔区90%混浊；C5，混浊程度超过C4。N0，透明核，胚胎核清楚可见；N1，早期核混浊；N2，中等程度核混浊；N3，严重核混浊。

1.5 氧化应激指标检测

12周后，腹腔静脉采血，用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法检测大鼠血清中MDA、SOD、GSHPx的活性，具体操作按试剂盒说明操作：酶标板加入标准品，每孔加入血清样本100 μL，37℃下孵育20 min，洗涤液洗涤3次；加入显色剂，避光显色5 min，加入终止液50 μL，在酶标仪412 nm测GSH-Px光密度值（optical density，OD），在酶标仪450 nm测MDA、SOD的OD值，计算样品浓度。

1.6 晶状体组织中ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras基因表达

采用荧光定量PCR检测：用Trizol试剂提取并纯化晶状体RNA，并逆转录成cDNA。20 μL反应体系中含有:2×plus SYBR real-time mixture 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA模板2 μL、重蒸水6.8 μL、ROX I 0.4 μL。95 ℃预变性30 s后，进入40个循环:95 ℃×10 s、56 ℃×30 s、72 ℃×30 s，最后95 ℃×15 s、60℃×1 min、95℃×15 s、60℃×15 s。检测ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras基因表达时以GAPDH作为内参（表1）。采用2-ΔΔCt方法用于比较每组中各基因的表达水平,ΔCT=CTERK1/ERK2/MEK/Raf/Ras-CTGAPDH，ΔΔCT=ΔCTMG组-ΔCTCG组，ΔΔCT=ΔCTDOP组-ΔCTMG组。所有PCR一式三份进行，并通过熔解曲线对单峰的存在进行验证。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验进行。计数资料采用Kruskal-Wallis检验。当P＜0.05时，则认为差异具有统计学意义。

表1 RT-qPCR引物序列

2 结果

2.1 各组大鼠晶状体混浊程度对比

注射STZ后12周在裂隙灯下大鼠晶状体照相及混浊评定结果，可见对照组晶状体混浊评定几乎都在C0N0，模型组绝大多数晶状体混浊程度在C3-4、N1-2，DOP组晶状体混浊程度评定大部分在C1-2、N0-1，对照组大鼠晶状体基本未发生混浊，保持透明；模型组晶状体几乎完全混浊；DOPH组晶状体出现絮状、片状等部分混浊，混浊程度较模型组明显减轻（表2、图1）。三组间比较，差异有统计学意义（χ2皮质=49.401，χ2核=43.914，均P=0.000）。

2.2 DOP对糖尿病大鼠血清中氧化应激指标的影响

MDA含量：模型组大鼠血清MDA含量较对照组明显升高，差异有统计学意义（t=4.615,P=0.000），DOP作用后大鼠血清MDA含量较模型组明显下降，DOP剂量越高，MDA含量下降越明显，组间比较差异均有统计学意义（tDOPL=4.046，tDOPM=6.504，tDOPH=6.587,均P=0.000）。

GSH-Px活力：模型组大鼠血清GSH-Px较对照组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），DOPL组和DOPM组与对照组和模型组差异均无统计学意义（P＞0.05），DOPH组较对照组（CG）和DOPL组明显升高，差异有统计学意义（tCG=2.728，P=0.011；tDOPL=2.068，P=0.048）。

SOD活力：模型组大鼠血清SOD活力较对照组明显降低，差异有统计学意义（t=9.809,P=0.000），DOP作用后，DOPL组与模型组差异无统计学意义（P＞0.05），DOPM和DOPH组均较模型组升高，差异有统计学意义（tDOPM=2.914，P=0.007；tDOPH=13.305,P=0.000），但DOPM组与DOPH组之间差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

2.3 DOP对糖尿病大鼠晶状体ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组（MG）、DOPL组、DOPM组的ERK1 mRNA呈高表达，差异有统计学意义（tMG=4.569，P=0.000；tDOPL=2.072，P=0.041；tDOPM=2.423，P=0.017）；随着DOP浓度增高，ERK1 mRNA表达水平逐渐降低，DOPH组ERK1 mRNA表达水平较对照组更低，差异有统计学意义（t=7.849，P=0.000）；与对照组比较，模型组、DOPL组、DOPM组的ERK2 mRNA呈高表达，差异有统计学意义（tMG=3.710，P=0.000；tDOPL=2.542，P=0.013；tDOPM=2.934，P=0.024）；随着DOP剂量增高，ERK2 mRNA表达水平逐渐降低，DOPH组ERK2 mRNA表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，模型组与DOP三个剂量组的MEK mRNA呈高表达，差异均有统计学意义（tMG=4.091，P=0.000；tDOPL=4.046，P=0.001；tDOPM=4.493，P=0.000；tDOPH=4.403，P=0.000）；但模型组与DOP三个剂量组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，模型组、DOP三个剂量组的Raf mR-NA呈高表达，差异有统计学意义（tMG=4.546，P=0.000；tDOPL=2.911，P=0.036；tDOPM=6.195，P=0.000；tDOPH=8.494，P=0.000）；随着DOP浓度增高，Raf mRNA表达水平逐渐降低；与对照组比较，模型组、DOPM组的RasmRNA呈高表达，差异有统计学意义（tMG=3.083，P=0.020；tDOPM=4.297，P=0.000）；DOPM组的Ras mRNA表达水平较DOPL组升高，差异有统计学意义（t=2.913，P=0.036）（表4）。

表2 DOP对糖尿病大鼠晶状体混浊程度的影响（眼只数，n=20）

图1 各组晶状体在体裂隙灯显微镜下照片（×10）。1A对照组；1B模型组；1C DOPH组。DOPH铁皮石斛多糖高剂量组

表3 DOP对糖尿病大鼠血清中氧化应激指标的影响（，n=10）

表3 DOP对糖尿病大鼠血清中氧化应激指标的影响（，n=10）

注：* 与对照组比较，P＜0.05；▲与模型组比较，P＜0.05；# 与DOPL组比较，P＜0.05；△与DOPM组比较，P＜0.05；MDA丙二醛；SOD超氧歧化物酶；GSH-Px谷胱甘肽过氧化物酶；DOPL铁皮石斛多糖低剂量组；DOPM铁皮石斛多糖中剂量组；DOPH铁皮石斛多糖高剂量组

3 讨论

糖尿病性白内障是糖尿病第二大眼部并发症，因其高发病率和高致盲率，糖尿病性白内障成为越来越多的学者研究的热点。目前，对于糖尿病性白内障的发病机制尚未完全明确,主要有多元醇渗透学说、氧化损伤学说和晶状体蛋白非酶糖基化学说，其中氧化应激在糖尿病性白内障的发生发展过程中意义尤为重要。糖尿病性白内障的产生与高糖环境下机体内活性氧及其代谢产物、衍生的活性物质等增多，抗氧化酶相对不足，或氧化物与抗氧化物间的比例失调密切相关[8]。

糖尿病性白内障属中医学“消渴病圆翳内障”范畴，晶珠属肾，肝藏血，肾藏精，肝血依赖肾精的滋养，肾精亦赖肝血才能化生。若肝肾不足，脏腑精血之气不能上荣于目，导致晶珠失养，则易生内障，“因知肝肾无邪，则目决不病”，说明肝肾不足，阴精亏损是本病的主要病因。铁皮石斛味甘微寒，归胃、肾经，具有益胃生津、滋阴清热等功效，主治热病津伤、口干烦渴、胃阴不足、食少干呕、病后虚热不退、阴虚火旺、骨蒸劳热等症。DOP是铁皮石斛主要成分之一，其现代药理作用广泛，如DOP能够显著提高糖尿病小鼠肝脏和胰腺的抗氧化能力，修复肝脏和胰腺氧化损伤，从而提高胰岛素含量和缓解胰岛素抵抗，具有降血糖的作用。同时，DOP也有改善糖尿病小鼠血脂代谢紊乱、改善肾脏损伤的作用；DOP可通过清除羟基自由基从而抑制其诱导的SH-SY5Y细胞凋亡；其还具有增强免疫、抗肿瘤等作用[6]。

本研究结果发现，STZ注射后的糖尿病性白内障模型组大鼠血清SOD活力较对照组下降，MDA含量较对照组升高，SOD是生物体内天然的超氧化物阴离子自由基（）清除剂，它能使变为H2O2与O2，MDA是膜脂质过氧化最重要的产物之一，说明高糖可通过氧化损伤介导糖尿病性白内障的产生。而DOP作用后，SOD活力增强，MDA含量降低，说明DOP可能通过减轻晶状体的氧化损伤从而防治糖尿病性白内障。这与既往学者的报道一致[9-10]。本研究结果还发现模型组GSH-Px虽然升高，但与对照组比较并无统计学意义，研究结果与其他学者[11-12]的STZ注射后的糖尿病大鼠的GSH-Px活力值升高不同，考虑可能因为GSH-Px值的影响因素较多，如体内硒类物质的蓄积、底物GSH的量等[13]。但从目前临床上关于糖尿病患者红细胞GSH-Px活力值报道也存在不一致，糖尿病患者GSH-Px可升高也可降低[14-15]，具体原因尚需进一步实验研究证实。本研究中在观察DOP对糖尿病性白内障大鼠氧化应激相关的ERK信号通路活化中关键分子mRNA表达时发现，STZ诱导的糖尿病性白内障大鼠晶状体组织中Ras、Raf、MEK、ERK1/2的基因表达水平均高于对照组。经不同浓度的DOP干预后，ERK1、ERK2和Raf的基因表达随浓度升高而降低，这种变化规律与MDA和SOD的变化一致，且与黄亚琳等[16]的研究结果一致，说明DOP可能通过介导ERK/Raf信号通路减轻糖尿病大鼠晶状体的氧化损伤。

表4 DOP对糖尿病大鼠晶状体ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras的mRNA表达的影响（，n=3）

表4 DOP对糖尿病大鼠晶状体ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras的mRNA表达的影响（，n=3）

注：* 与对照组比较，P＜0.05；▲与模型组比较，P＜0.05；# 与DOPL组比较，P＜0.05；△与DOPM组比较，P＜0.05；DOPL铁皮石斛多糖低剂量组；DOPM铁皮石斛多糖中剂量组；DOPH铁皮石斛多糖高剂量组

综上所述，DOP可通过降低糖尿病大鼠血清中MDA含量，提高血清中SOD的活力，增强其抗氧化能力，其中氧化应激介导的ERK/Raf信号通路可能是DOP延缓糖尿病性白内障的重要机制之一。