李 强

自然资源部/广西岩溶动力学重点实验室, 中国地质科学院岩溶地质研究所, 广西桂林 541004;

联合国教科文组织国际岩溶研究中心, 广西桂林 541004

在我国西南岩溶区, 人地矛盾突出, 植被破坏,水土流失严重, 产生了大量的石质荒漠化现象(Jiang et al., 2014)。为扼制石漠化扩展趋势, 我国相继实施了退耕还林工程、天然林保护工程和长江、珠江防护林工程, 使土地利用/覆被发生相应的变化(Jiang et al., 2014)。土地利用方式的改变可影响土壤结构、土壤生物多样性-稳定性及土壤生物地球化学循环过程, 并显著影响陆地生态系统的结构和功能(Porazinska et al., 2003; Dayamba et al., 2016)。

以土壤微生物和土壤无脊椎动物为主的土壤生物不但是土壤的重要组成部分, 而且还对土壤的生长发育、土壤肥力的形成和演变, 以及高等植物的营养供应具有重要的影响(Delgado-Baquerizo et al., 2020)。加之土壤生物对土地利用变化十分敏感(Fell et al., 2006; Banerjee et al., 2018), 喻文强等(2020)基于BIOLOG ECO微平板法发现贵州茂兰岩溶区乔木林逆向演替为灌丛时土壤微生物活性逐渐降低。王显等(2020)进一步指出茂兰岩溶区不同土地利用方式的土壤真核微生物群落结构也存在差异。何敏红等(2019)发现岩溶石漠化程度对真菌组成及多样性的影响高于土地利用方式。此外, 戴祥艳等(2019)指出岩溶区不同土地利用方式对土壤动物的群落结构、多样性、功能类群也产生重要的影响。这些发现为进一步评估岩溶土壤生态系统对土地利用/覆被变化的响应提供了重要基础资料, 然而由于土壤生物群落包括微生物与微型动物, 如果仅从微生物或微型动物角度研究则无法系统评估土地利用/覆被变化对岩溶土壤生态系统的响应。

岩溶断陷盆地作为我国石漠化综合治理重要类型区之一, “盆-山”地形变化剧烈, 气候反差大,土壤流/漏失严重, 植被立地条件差, 群落生态系统恢复缓慢(李强等, 2017)。尽管之前已有学者对云南岩溶断陷盆地土地利用与土壤微生物和酶活性特征开展了研究工作(牟凌等, 2020; 邱江梅等, 2020;Qiu et al., 2020), 但尚未涉及土地利用方式对岩溶断陷盆地土壤细菌和真核生物群落结构的影响。为此, 本研究以地处云南泸西小江岩溶盆地的三塘乡为研究区域, 采用空间换时间的方法研究不同土地利用方式下的土壤细菌和真核生物群落结构, 以期从土壤生物学角度为土地利用结构优化提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

三塘乡位于云南省泸西县县境东南部, 地处东经 103°46′13〞—103°57′20〞, 北纬 24°21′03〞—24°31′00〞之间。地势西北高东南低, 境内高山连绵,峡谷纵横, 山高坡陡, 形成了峡谷、陷塘、山梁相间的复杂地貌。该区主要出露地层为T2gc泥晶灰岩、白云岩(李强等, 2017)。最高海拔2459 m, 位于阿定老佐坟箐处, 最低海拔 820 m, 位于南盘江小河口,气候差别较大。年平均气温 13～14℃, 年降雨量1000 mm左右。

1.2 样品采集

2018年1月野外采集土壤样品, 选择弃耕地、草地、人工林和天然林等四类土地利用方式。草地样地的主要植物为蕨类、蛇莓(Duchesnea indica(Andr.) Focke)、白羊草(Bothriochloa ischaemum(L.)Keng)等; 人工林样地的主要植物为云南松(Pinus yunnanensis); 天然林样地的主要植物为榛树(Corylus heterophyllaFisch)、云南松(Pinus yunnanensis)、阴香(Cinnamomum burmanni(Nees et T.Nees) Blume)和云南杜鹃(Rhododendron yunnanenseFranch.)。每类样地沿“S”型设置4个10 m2的样方, 每个样方采用 5点混合样采集 0～10 cm土样,共采集16个土样。土壤样品用保温箱保存并带回实验室去除植物根系和碎片等侵入体后, 一部分经风干、混匀后, 过100目筛, 供土壤理化性质分析, 一部分土样放入–80 ℃冰箱中保存用于土壤细菌和真核生物群落结构分析。

1.3 测定方法

土壤基本理化性质测定参考鲁如坤(1999)的方法: 土壤 pH 值采用电位计法测定(水土比为 2.5∶1)、土壤有机碳(TOC)含量采用高温外热重铬酸钾氧化-容量法测定; 全氮(TN)含量采用浓硫酸消煮—凯氏定氮法测定; 总磷(TP)含量采用盐酸-氟化铵法测定; 速效钾(AK)含量采用乙酸铵浸提法测定; 交换性钙(EC-Ca2+)和交换性镁(EC-Mg2+)采用乙酸铵交换—EDTA络合滴定法测定。

采用 MOBIO土壤 DNA提取试剂盒提取土样DNA后, 选用高通量测序引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′) 和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物对细菌16S rRNA V3-V4可变区进行PCR扩增, 选用528F(5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3′)和706R(5′-AATCCRAGAATTTCACCTCCAA-3′)引物对真核生物18S rRNA V4区进行PCR扩增。上述引物806R和706R均存在一段12 bp的Barcode序列进行不同样品的区分。扩增产物在广东美格基因科技有限公司采用Illumian HiSeq2500 PE250平台进行测序。

1.4 数据处理与分析

获得的正向与反向测序结果采用 FLASH软件进行拼接后, 采样 Usearch软件去除低质序列和嵌合体, 不同细菌样品高质量序列为 13430–22884,不同真核生物样品高质量序列为56213–109303。为了减少由于不同测序深度引起的潜在偏差, 细菌样品统一测序深度为 13430, 真核生物样品统一测序深度为56213。采用cluster命令对97%相似水平的OTU(operational taxonomic unit)代表序列进行分类学分析, 并把代表性OTU与Silva 132核糖体数据库进行细菌和真核生物进行比对。利用QIIME软件计算样品 α多样性指数和 β多样性距离(Weighted UniFrac)矩阵。同时基于Weighted UniFrac距离矩阵利用 R包(https://www.r-project.org/)比较不用土地利用方式下细菌和真核生物群落相似性(Analysis of similarities, ANOSIM)。用Pearson评价α多样性指数、细菌和真核生物优势属与土壤理化性质之间的关系。采用 Mantel分析基于 OTU相对丰度的Bray-Curtis距离与土壤理化性质之间的关系。在参考Wei et al.(2020)的基础上, 选择每一组内相对丰度大于0.1%的OTU利用Gephi 0.9.2软件绘制细菌和真核生物的互作网络图。利用 SPSS软件对数据进行统计分析及LSD方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同土地利用方式下土壤理化性质及化学计量学特征

表 1为四种土地利用方式下 SOC、TN、TP、AK、pH、EC-Ca2+、EC-Mg2+、C:N、C:P和N:P结果。在这四种土地利用方式中, TP和AK的质量分数均表现为弃耕地＞草地＞人工林＞天然林, 而C:N、C:P和N:P则表现出截然相反的变化趋势。此外, 在四种土地利用方式中, 草地中的TN、EC-Ca2+和EC-Mg2+质量分数最大, 天然林中的SOC质量分数最大以及人工林土壤pH值最低。此外, SOC、TN、TP、AK、pH、EC-Ca2+、EC-Mg2+、C:N、C:P 和N:P在四种土地利用方式中的差异性不尽相同。由此可见, 土地利用变化是影响土壤碳、氮、磷等元素空间变异及生态化学计量特征的重要因素。

表1 不同土地利用方式下土壤理化性质及土壤碳、氮、磷的化学计量学特征Table 1 Soil physicochemical properties and soil stoichiometric characteristics of carbon, nitrogen and phosphorus in different land-use types

2.2 不同土地利用方式下土壤细菌和真核生物群落特征

在四种土地利用方式中, Verrucomicrobia、Acidobacteria、Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Gemmatimonadetes、Bacteroidetes、Planctomycetes、Rokubacteria、Patescibacteria、Firmicutes和 Latescibacteria为细菌群落的优势门,其相对丰度＞97.28%; Charophyta、Metazoa、Fungi、Cercozoa、Ciliophora、Ochrophyta、Chlorophyta 和Labyrinthulomycetes为真核生物群落的优势界, 其相对丰度＞84.54%(图 1)。此外, 细菌群落中的Verrucomicrobia、Rokubacteria相对丰度均表现为弃耕地＜草地＜人工林＜天然林, Proteobacteria、Chloroflexi、Gemmatimonadetes、Bacteroidetes、Latescibacteria相对丰度均表现为弃耕地＞草地＞人工林＞天然林; 真核生物群落均没表现出明显的变化规律。此外, 土壤细菌和真核生物群落在每一个土样样品中的相对丰度也不尽相同, 进而反映出岩溶土壤的高异质性特征。通过进一步分析(表 2),发现土壤细菌α多样性指数均表现出弃耕地＞草地＞人工林＞天然林; 土壤真核生物Chao1指数为弃耕地＞天然林＞草地＞人工林, Shannon‐Wiener指数和Simpson指数为弃耕地＞天然林＞草地＞人工林。此外, 土壤细菌α多样性在弃耕地/草地和人工林/天然林等土地利用方式中存在显著差异, 土壤真核生物 Chao1指数在弃耕地与草地人工林/天然林等土地利用方式中存在显著差异, 土壤真核生物其他α多样性指标差异性不显著。通常认为α多样性是物种多样性, β多样性可用以测定群落的物种多样性沿着环境梯度的变化速率或群落间的多样性, 包括不同群落间物种组成的差异(Crist et al.,2003)。因此, 基于 Weighted UniFrac距离矩阵的ANOSIM分析结果表明, 不同土地利用方式下土壤细菌和真核生物群落存在显著差异(图2)。

表2 不同土地利用方式下土壤细菌和真核生物的α多样性指数Table 2 α diversity indices from soil bacteria and eukaryotes in different land-use types

图1 不同土地利用方式土壤细菌优势门(A)和真核生物优势界(C)及其他们在每一样品中的相对丰度(B和D)Fig. 1 Soil bacterial dominant phyla and eukaryota dominant kingdom in different land-use types (A and C) and in all soil samples (B and D)

图2 不同土地利用方式下土壤细菌(A)和真核生物(B)的ANOSIM组间差异分析Fig. 2 ANOSIM difference analysis of soil bacteria (A) and eukaryotes (B) between the four land-use types

2.3 不同土地利用方式下土壤细菌和真核生物互作网络特征

以每种土地利用方式中 4个样品测序所得OUT(相对丰度＞0.1%)为数据源构建土壤细菌-真核生物互作网络(图3)。弃耕地、草地、人工林和天然林的网络模块聚类系数分别为0.987、0.988、0.986和 0.969, 并高于网络模块聚类系数阈值0.4(Newman, 2006), 说明构建的互作网络具有模块化特征, 可用于进一步分析。

图3 弃耕地(A)、草地(B)、人工林(C)和天然林(D)土壤细菌-真核生物的互作网络Fig. 3 Co-occurrence networks and topological properties of bacteria and eukaryotes from abandoned farmland (A),grassland (B), artificial forest (C) and natural forest (D) soils

网络节点数、边数及平均度可反映网络的规模和复杂程度, 通过分析发现弃耕地、草地、人工林和天然林的土壤细菌-真核生物互作网络节点数分别为131、148、130和62, 边数分别为748、976、763和222, 平均度为11.420、13.189、11.738和7.160,并总体呈现出弃耕地＞草地＞人工林＞天然林的变化趋势。此外, 四种土地利用方式均以细菌节点比例最高, 并呈现出弃耕地＞人工林＞草地＞天然林的变化趋势; 而真核生物节点比例在四种土地利用方式中呈现出弃耕地＜人工林＜草地＜天然林的变化趋势, 说明生态恢复有助于改善土壤质量, 促进真核生物的繁衍(Chen et al., 2000; Pang et al., 2018)。

网络中的正负相关可用于推断土壤细菌与真核生物群落之间的共生或竞争/捕食关系, 本文研究结果表明四种土地利用方式的网络均以正相关为主,表明土壤细菌和真核生物群落之间的合作关系大于竞争/捕食关系。他们之间的合作关系比例大小为弃耕地＞草地＞天然林＞人工林。此外, 在网络的正负相关中, 细菌-细菌的比例大小为弃耕地＞人工林＞草地＞天然林; 细菌-真核生物的比例大小为弃耕地＜人工林＜草地＜天然林; 真核生物-真核生物的比例大小为人工林＜草地＜弃耕地＜天然林。

通过进一步分析四种土地利用方式的土壤细菌和真核生物生态网络关键节点, 可以发现四种土地利用方式的互作网络均以 Proteobacteria为优势类群, Acidobacteria和Fungi为主类群, 并具有一定的相似性(图3)。在天然林和人工林的生态网络关键节点组成中, Bacteroidetes低于草地和弃耕地, Verrucomicrobia高于草地和弃耕地, 并且天然林中的Metazoa和Fungi等真核生物最高。此外, 天然林的前六位优势属为Candidatus Udaeobacter(Verrucomicrobia 门)、RB41(Acidobacteria 门)、Acidobacteria Subgroup 6、Candidatus Solibacter(Acidobacteria门)、Rokubacteriales(Rokubacteria门)和Metagenome(真菌界); 人工林的前六位优势属为Candidatus Udaeobacter、Acidobacteriales(Acidobacteria门)、Bryobacter(Acidobacteria门)、Acidobacteria Subgroup 2、Candidatus Solibacter和RB41; 草地的前六位优势属为 Acidobacteria Subgroup 6、RB41、Gemmatimonadaceae(Gemmatimonadetes门)、Chitinophagaceae(Bacteroidetes门)、Agaricales(真菌界)和Pedosphaeraceae(Verrucomicrobia门); 弃耕地的前六位优势属为Acidobacteria Subgroup 6、Chitinophagaceae、Gemmatimonadaceae、RB41、SC-I-84 (Proteobacteria 门)和Blastocatellaceae(Acidobacteria门)。RB41通常在非施肥土壤富集(Ai et al., 2018), 并适应贫瘠土壤环境(Eo and Park,2016), 因此在水土流失严重的岩溶断陷盆地, RB41成为决定土壤生态系统的关键类群。

2.4 不同土地利用方式下土壤细菌和真核生物与土壤因子的相互关系

为进一步识别土壤因子对土壤细菌和真核生物群落的影响, 采用 Spearman 秩相关进行相关分析(其中 Bray-Curtis距离与土壤因子之间的关系采用Mantel 检验), 结果如图4所示。土壤细菌多样性与TP、AK、EC-Ca2+、C:N、C:P和N:P显著相关, 土壤真核生物多样性与土壤因子没有相关性。土壤细菌 Bray-Curtis距离与 SOC、TN、TP、AK、EC-Ca2+、EC-Mg2+、C:N、C:P和N:P显著相关, 而土壤真核生物 Bray-Curtis距离与 TP、EC-Ca2+和 SOC显著相关。由于土壤生物对生物地球化学循环过程的调控具有专有功能和一般功能特征(Crowther et al.,2019), 因此土壤细菌和真核生物优势属与某些土壤因子显著正相关或负相关。尽管土壤 pH值被认为是影响土壤生物生存与发育的重要因素, 但考虑到石灰性土壤特点(曹建华等, 2003), 因此本文土壤pH与土壤细菌和真核生物群落的关系并不显著(P＞0.05)。

图4 土壤细菌和真核生物多样性、Bray-Curtis距离、优势属与土壤理化性质和土壤碳、氮、磷的化学计量学特征的相关性Fig. 4 Correlations between bacterial and eukaryota diversity, community structures, dominant genera and edaphic physicochemical variables as well as stoichiometry characteristics

3 讨论

目前关于土地利用方式变化对岩溶土壤理化性质、土壤碳、氮、磷的化学计量学特征及微生物群落结构的影响已有较深入的研究(何敏红等, 2019;吴鹏等, 2019; 牟凌等, 2020; 王显等, 2020; 喻文强等, 2020), 而关于土地利用方式变化对岩溶土壤细菌-真核生物的影响研究较少。一般来讲, 土壤有机质 C:N比与其分解速度呈反比, 因此土壤有机质C:N较低表明其具有较快的矿化速率, 造成土壤有机质中的有效氮质量分数偏高(王绍强和于贵瑞,2008)。本研究结果表明, 随着土地覆被(弃耕地＜草地＜人工林＜天然林)的增加 C:N 逐渐升高, 这与曾凡鹏等(2016)关于生态正向演替过程中C:N逐渐增加的结果一致。此外, 土壤 C:P越低通常说明磷的有效性越高(Sterner and Elser, 2002), 因此随着土地覆盖度的增加, 土壤中磷的有效性正在逐渐降低。通过进一步对比我国不同地区土壤 N:P, 发现本研究弃耕地土壤 N:P平均接近青藏高原高寒草原(土壤 N:P为 1.59)并远低于亚热带常绿阔叶林(土壤N:P为8.62)(王建林等, 2013)。加之, 生物的生长速率与C:N、C:P和N:P比存在负相关的关系(Elser et al., 1996; Liu et al., 2010), 因此本研究结果显示土壤细菌多样性以及大部分土壤细菌和真核生物的优势属与C:N、C:P和N:P比存在显著负相关关系, 并且细菌在弃耕地生态网络中占绝对优势。此外, 随着弃耕地、草地、人工林、天然林演替时间的推移, 细菌节点比例减少、真核生物节点比例增加, 这是因为弃耕地生态系统处于生态系统演替的早期阶段, 土壤有机物质含量低, 这样的环境在生态学上被认为群落之间的竞争作用较弱(Brown and Jumpponen,2014), 因此细菌作为早期的先锋类群占据主导地位。相反, 随着植物的定植和土壤有机质增加, 真核生物在日趋成熟的土壤中能够获取更多的有机物质资源导致其竞争作用加强(Treseder and Lennon,2015)。

土壤中的氮磷不但是限制植被生长和群落演替的重要养分(王建林等, 2013; 曾凡鹏等, 2016), 而且还是影响微生物活性和群落结构的重要因素(Liu et al., 2010)。本研究结果显示土壤细菌和真核生物群落和多样性受土壤中氮磷限制的共同作用, 但主要受土壤磷素的限制作用, 这一研究结果与岩溶土壤生态系统磷限制问题突出的结论一致(Du et al.,2020)。土壤钾主要来源于母质矿化和生物地球化学循环补充, 由于碳酸盐岩钾含量远低于其它岩石,因此碳酸盐岩释放的钾远低于生物所需, 导致土壤钾耗损(Shen et al., 2020), 进而制约土壤细菌和真核生物群落和多样性。Ca2+和Mg2+作为微生物所需的一种微量元素, 参与细胞的能量代谢, 调控细胞增殖与分化, 刺激微生物生长, 提高微生物活性,因此大部分土壤细菌和真核生物的优势属与他们显著相关, 这一研究结果与 Ca2+是影响岩溶土壤细菌群落的结论一致(Xue et al., 2017)。微生物不但是土壤有机碳转化的重要参与者, 而且通过合成代谢作用能将有机碳转化为自身细胞组成, 待其死亡后以微生物残体形式在土壤中积累, 成为土壤固碳的主力军(Ma et al., 2018), 进而与土壤有机碳显著相关。

土壤生物群落中的一些关键类群在土壤生态系统功能中起着重要的作用, 因此岩溶土壤生物关键类群的筛选和确定对开展石漠化治理和生态重建具有重要的作用。本文研究结果表明: RB41是决定岩溶断陷盆地土壤细菌-真核生物系统的关键类群。然而Xue et al.(2017)发现云南富源县岩溶土壤的细菌关键类群为GR-WP33-30, 这是因为岩溶土壤异质性高, 并且季节变化决定了环境中微生物群落的结构和组成性质, 因此, 关键种可能只在特定的季节或时间段内出现(Banerjee et al., 2018)。此外, 与受人类活动影响程度较深的弃耕地和人工林相比, 天然林和草地中的真菌成为优势属。这是因为植被是影响真菌群落的重要因素, 一方面不同的植物产生不同的分泌物, 影响土壤生物群体的组成, 另一方面植物能与某些土壤真菌共生或者形成菌根, 来提高土壤生态系统的稳定性(王芳和图力古尔, 2014)。

4 结论

(1)岩溶断陷盆地不同土地利用方式土壤碳氮磷化学比存在差异, C:N、C:P和N:P总体表现出弃耕地＜草地＜人工林＜天然林。土壤细菌和真核生物多样性与C:N、C:P和N:P变化趋势相反。

(2)土壤磷、钾和钙是影响岩溶断陷盆地土壤细菌和真核生物群落结构和多样性的关键因素。

(3)RB41是决定岩溶断陷盆地土壤细菌-真核生物网络系统的关键类群。

致谢:桂林医学院黄雅丹助理研究员为本文数据处理提供的支持和帮助, 在此特致谢意！

Acknowledgements:

This study was supported by National Key Research and Development Program of China (No.2016YFC0502501), and Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund (No.2020022).