高险亭 卢岭 梁耕田 陈应超 吴龙军

血管纹位于耳蜗中阶外侧壁,是维持耳蜗内环境稳定和内淋巴电位的器官。研究发现，内淋巴平衡破坏可造成外毛细胞的凋亡[1]。血-迷路屏障结构包括血管纹微血管内皮细胞、周细胞、基膜、复杂的紧密连接和粘合连接，它们类似于细胞间信号传导，能控制血管渗透性以及为听功能提供适宜的环境[2]。在基因遗传缺陷、各种炎症刺激、氧化应激、噪声损伤以及衰老细胞凋亡的病理条件下，血-迷路屏障细胞间相互作用导致其通透性增加，内外淋巴各种离子成分改变，耳蜗电位受影响，从而导致听力障碍[3]。本研究拟通过观察老化型C57BL/6J小鼠耳蜗外侧壁血管纹紧密连接蛋白(Claudin-5)、核转录因子(NF-κB)、细胞周期抑制蛋白(P21)的表达，探讨血管纹的改变对老年性聋发病相关机制的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 SPF级健康C57BL/6J小鼠(江苏常州卡文斯实验动物有限公司)40只，分为两组，青年组(3月龄)20只，体重10～15 g；老年组(24月龄)20只，体重25～40 g;均排除中耳及内耳疾病。

1.2听性脑干反应(ABR)测试 两组小鼠均在隔声屏蔽室内用10%水合氯醛(330 mg/kg)腹腔注射麻醉，采用美国Nicolet Compass系统的ABR检测仪检测各组小鼠ABR阈值;记录电极刺入前颅顶正中皮下，参考电极刺入受试耳乳突皮下，接地电极刺入对侧耳后皮下，TDH-39型耳机给声，声源距耳廓1 cm，用交替短声(click)做刺激声，重复率10次/秒。滤波范围32～3 000 Hz，扫描时间10 ms，叠加512次;以引出可重复出现ABR波Ⅱ的最小刺激强度作为反应阈值。

1.3耳蜗取材及切片 两组小鼠完成ABR测试麻醉苏醒后快速引颈脱臼断头处死，取颞骨，打开听泡，暴露耳蜗，蜗尖钻孔，置于4%多聚甲醛溶液(pH7.4)4 ℃冰箱内固定20 h，PBS反复冲洗，10%EDTA(pH7.4)常温脱钙7天后，自来水冲洗数小时后，依次脱水、二甲苯、浸蜡、包埋，沿蜗轴纵向切片(厚度4 μm)，烤干后切片分别行HE染色和免疫组化染色。

1.4HE染色和免疫组化染色 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)HE染色：取出制备好的石蜡切片经二甲苯脱蜡、不同梯度酒精水化和蒸馏水冲洗后，3%过氧化氢室温孵育切片10 min，将其放入适量的枸橼酸抗原修复液的烧杯，于水浴锅中加热至90 ℃(NF-κB，P21均加热至96 ℃)15 min，室温冷却，置于PBS缓冲液中，用于下一步组化染色准备。

免疫组化染色：参考PV9001说明书，将上述PBS缓冲液中的切片分别滴加浓度为1∶200兔抗鼠Claudin-5多克隆抗体(abcom)，37 ℃孵育60分钟；浓度1∶100兔抗鼠NF-κB多克隆抗体(abcom)，4 ℃过夜；浓度1∶50兔抗鼠P21多克隆抗体(abcom)，4 ℃过夜。用PBS缓冲液洗3 min×3次，滴加适量的增强酶标山羊抗兔G聚合物室温20分钟，室温孵育 15 min。PBS缓冲液洗3 min×3次。DAB显色，水洗，复染，脱水，透明，封片，显微镜下阅片。用PBS缓冲液代替一抗作为标本染色的阴性对照，标本中胞膜、胞浆及胞核中出现棕黄或者棕黑色颗粒为阳性染色。

1.5反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测 将分离耳蜗组织按常规颈椎脱臼法处死两组小鼠各10只，剥离出双侧颞骨，置入二乙基焦碳酸酯水配制的PBS中，在显微镜下打开听泡，去除骨性耳蜗，仔细剥离出血管纹组织，液氮中速冻-70 ℃保存。Trizol法抽提耳蜗组织标本总RNA，取1 μg总RNA产物加oligo(dT)1 μl，再加DEPC水至总量达12 μl，65 ℃5 min，立即置于冰上骤冷。按下列体系合成cDNA：上述变性的RNA液12 μl，5×RT Buffer 4 μl，dNTP Mixture 2 μl，震荡混匀后，经过30 ℃10 min，42 ℃20 min，85 ℃5 min，40 ℃5 min后瞬时离心，获得cDNA模板，合成产物-20度保存。

引物设计根据GenBank检索小鼠Claudin-5、NF-κB、P21的核苷酸序列，利用Premier design软件设计特异性上下游引物，Claudin-5引物：上游5'-TTCGCCAACATTGTCGTCC-3'，下游5'-TCTTCTTGTCGTAGTCGCCG-3'；NF-κB引物:上游5'-AGCACAGATACCACCAAGACC-3'，下游5'-GGGCACGATTGTCAAAGAT-3'；用GAPDH做内参，其引物为：上游5'-CTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，下游5'-GGATGATGTTCTGGAGAG-3'。具体步骤参照TAKARA PrimeScript One Step RT-PCR Kit试剂盒使用说明进行操作，在PCR管中加入20 μl反应体系，含灭菌超纯水7 μl，PCR Mix10 μl，上下游引物各1 μl，模板cDNA1 μl。反应程序：Claudin-5:98 ℃ 30 min→98 ℃ 30 s→63 ℃ 30 s→72 ℃2 min，循环30次，72度延长8 min，NF-κB：95 ℃ 30 min→94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃2 min，P21：95 ℃ 30 min→95 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃2 min，72度延长7 min，各循环30次，采用GAPDH引物进行PCR反应作为参照，根据PCR实验结果可知各指标△CT值，采用2-△△CT方法计算各指标表达水平比率即2-△△CT表达量的比值。以2-△△CT表示Claudin-5、NF-κB、P21相对量，计算老龄小鼠耳蜗各指标相对量。

1.6Claudin-5、NF-κB、P21表达 用PBS缓冲液代替一抗作为标本染色的阴性对照，标本中胞膜、胞浆及胞核中出现棕黄或者棕黑色颗粒为阳性染色。

1.7统计学方法 应用SPSS14.0软件，采用两样本t检验对数据进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组小鼠ABR反应阈比较 两组小鼠ABR阈值见表1，可见，老年组小鼠ABR阈值明显高于青年组小鼠，差异有统计学意义(P<0.01)，符合老年性聋表现。

表1 两组小鼠ABR阈值及RT-PCR检测耳蜗内Claudin-5、NF-κB、P21蛋白表达水平

2.2耳蜗血管纹形态学观察 HE染色高倍镜下观察青年组、老年组C57BL/6J小鼠耳蜗血管纹形态结构，可见青年组血管纹边缘细胞排列整齐、有序、致密，中间细胞毛细血管网丰富，基底细胞呈串珠样排列(图1a)，老年组血管纹显示萎缩，细胞疏散，分布不均(图1b)。

图1 两组小鼠血管纹高倍镜下观(HE×400)(箭头所示)

2.3免疫组化染色结果 Claudin-5在青年组C57BL/6J小鼠外侧壁血管纹中大量表达，边缘细胞、中间细胞和基底细胞均有染色，且染色较深;在老年组少量表达于边缘细胞核中间细胞；NF-κB、P21在青年组小鼠血管纹中表达较少，在老年组中高表达于边缘细胞和中间细胞(图2)。

图2 Claudin-5、NF-κB、P21在两组小鼠耳蜗外侧壁血管纹表达(免疫组化×600) 黑色箭头示边缘细胞，蓝色箭头示中间细胞，红色箭头示基底细胞); a.b分别显示Claudin-5在青年组和老年组C57BL/6J小鼠外侧壁血管纹表达，在青年组小鼠边缘细胞、中间细胞和基底细胞及散在的螺旋韧带结蹄组织细胞均有染色，且染色较深，在老年组少量表达于边缘细胞和中间细胞；c.d分别显示NF-κB在青年组和老年组C57BL/6J小鼠外侧壁血管纹表达；e.f分别显示P21在青年组和老年组C57BL/6J小鼠外侧壁血管纹表达，在老年组中高表达于边缘细胞和中间细胞

2.4RT-PCR结果 两组小鼠耳蜗内Claudin-5、NF-κB、P21的表达水平见表1，可见，与青年组相比，Claudin-5在老年组耳蜗内表达降低(P<0.05)；NF-κB和P21在老年组耳蜗中表达增强(P<0.05)。

3 讨论

随着全球人口老龄化的进程，老年性聋发病率逐渐增高，其发生年龄、发展速度、听力损失程度及对生活的影响等因人而异，近年来对耳聋研究也越来越深入，包括突触退化、内耳免疫、基因治疗和载体研发等研究取得了一定的进展[4]。老年性聋病因复杂，与很多系统性疾病相关，如糖尿病、高血压、高脂血症等影响微循环的心脑血管疾病，临床发现老年性聋患者中“三高”人群比例较高。本实验以微循环障碍对内耳造成血供不足为出发点，研究老龄化小鼠耳蜗外侧壁血管纹组织结构和分子间连接是否异常，探讨血管纹的异常改变是否影响内耳血供导致听力减退，以探索耳聋发生过程的分子信号途径。

C57BL/6J小鼠是模拟人类年龄相关性听力下降比较成熟的动物模型，其16周龄开始出现听力减退，26周龄听力明显下降[4]。本研究结果显示老年组小鼠ABR反应阈高于青年组，符合老年性聋的表现;本研究通过观察青年组和老龄组小鼠模型耳蜗血管纹Claudin-5、NF-κB、P21的表达差异，探讨Claudin-5、NF-κB、P21对老年小鼠血管纹的影响及其在老年性聋发病机制中的作用。Claudin-5是内皮细胞紧密连接的重要成分，在不同的组织表达不同，与血脑屏障通透性的改变密切相关，是近年的研究热点。已有研究表明[5]Claudin-5表达异常时可导致内皮细胞间结构受损。Shoichro等[6]认为Claudin-5是调节脑血管内皮细胞通透性最重要的调节因子；Ishizaki等[7]的研究证明，cAMP可以通过依赖或非依赖蛋白激酶A途径，通过苏氨酸磷酸化上调猪血脑屏障上Claudin-5的表达，从而促进内皮细胞上紧密连接的功能;后者可激活转录因子NF-κB，此信号分子是多种“损伤反应基因”的多效转录调节因子[8]，NF-κB活化还可以通过调控细胞周期蛋白(如P21)的表达而抑制细胞生长，P21蛋白参与细胞的生长、分化、衰老及死亡过程[9]。近年来有实验表明紧密连接蛋白在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹紧密连接中的高浓度表达与维持血迷路屏障结构、功能密切相关[10]。老年组小鼠血管纹萎缩，细胞间连接缝隙增大，血管内皮细胞萎缩或闭塞，提示C57BL/6J小鼠随着老化的进程，血管纹萎缩可能导致离子通道异常开放，内淋巴循环障碍，最终导致听力下降。本研究结果显示Claudin-5蛋白在老年组小鼠萎缩的血管纹中低表达，在耳蜗内的含量亦减少，表明Claudin-5表达异常导致血管内皮细胞结构受损萎缩；进一步观察NF-κB、P21在耳蜗外侧壁血管中的表达发现，NF-κB、P21在老年组小鼠血管纹中高表达，提示NF-κB、P21在衰老的进程中表达增多。推测氧化应激、血管变性萎缩等体内衰变多种因素刺激cAMP通过依赖或非依赖蛋白激酶A途径，下调Claudin-5的表达，激活下游因子NF-κB产生促炎反应，导致血管纹内皮细胞通透性增大，离子通道异常开放，内淋巴失衡，并激活P21，抑制细胞周期的进程，最终引起内耳缺血，听觉细胞凋亡或坏死，导致听力下降。

综上所述，Claudin-5、NF-κB、P21在老年组C57BL/6J小鼠耳蜗外侧壁血管纹内均有表达，Claudin-5表达低可能与血管纹通透性相关，NF-κB 和P21表达增多可能与内外淋巴循环紊乱和细胞凋亡有关，其具体机制还需进一步研究。