王 洋,杨雪玲,易 玲,丁小双,钟 懿,于 洁,王 侃*,莫春阳

（1.宁波大学 土木与环境工程学院,浙江 宁波 315211;2.宁波中科检测技术服务有限公司,浙江 宁波 315105;3.三门峡市春和建材有限公司,河南 三门峡 472135）

医药类污染物是近年来出现的一类“新兴污染物”,其主要来源于医药品的大量生产和使用.中国已成为最大的原料药生产国,且对药物的消耗速率惊人[1].近年来,各种医药品不断在地表水、地下水、饮用水、土壤和动植物体内检出,这些物质广泛存在,持久性较强,对生态环境具有较大的潜在危害[2-3].医药类污染物对生态环境和人体的影响主要体现在抗生素抗性、内分泌干扰和生态毒性等方面,其产生作用的质量浓度可低至ng·L-1[4].抗生素类药物进入环境后,会引起细菌的抗性,进而导致人类的致病菌产生抗性[5].一些医药类污染物会导致生物体的内分泌系统失衡,如干扰细胞的酶活性,改变血细胞吞噬作用,影响细胞粘附作用以及脂质过氧化作用等[6].同时,土壤中的一些医药类污染物会被植物吸收和积累,并对植物生长产生不利影响[2,7].

氟喹诺酮(Fluoroquinolones,FQs)是一类广谱抗生素医药品,近年来生产量和使用量快速增加,目前占全球抗生素市场份额的15.3%.FQs 的大量使用导致其在环境中的检出频率和检出浓度不断升高.市政污水处理厂是FQs 进入环境的重要点源[8].在世界各地污水处理厂中,已检出大量高浓度FQs[8-10].在我国污水处理厂进水和出水中,已检出氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)的质量浓度达368～3 675 ng·L-1和 165～1 561 ng·L-1,诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)的质量浓度达263～2 746 ng·L-1和85～1162 ng·L-1,环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)的质量浓度达268 ng·L-1和199 ng·L-1[11-12].这些污染物会随污水厂出水进入地表水体,产生较大的生态毒性风险,如影响水生动物肝细胞的氧化代谢,导致氧化损伤;诱导水体产生FQs 抗性细菌等,产生作用的质量浓度可低至ng·L-1～μg·L-1[13].同时,FQs 由水体迁移至土壤中后,在ng·g-1的质量浓度下即可影响土壤微生物群落结构,且会在植物中富集,并通过食物链进入人体[14].

在污水处理流程中,活性污泥的吸附作用是FQs 从污水中去除的主要机制(FQs 较难生物降解),这导致污泥中累积了种类繁多、质量浓度很高的FQs,如3 450～24 760 ng·g-1DS(干固体)OFL、240～5 280 ng·g-1DS NOR、6 858 ng·g-1DS CIP[3,15-17].然而,污泥基质的复杂性导致污泥中FQs 的检测流程复杂且回收率较低.目前主要采用超声、微波或加压溶剂等提取方法结合固相萃取、液相色谱质谱联用仪等分析检测污泥中的FQs,其中涉及到的操作参数及变量较多,如提取溶剂种类及浓度、固相萃取方法、色谱操作条件等,且液相色谱质谱联用仪分析成本高昂.因此,需对检测流程和操作参数进行优化,探索准确、高效且成本较低的污泥中FQs 的分析检测方法[18-19].

OFL、NOR、CIP 是污泥中检出频率和检出浓度最高的3 种FQs,本文通过优化污泥中FQs 的提取方法、固相萃取方法、液相色谱参数等,得到一种能够同时检测污泥中OFL、NOR、CIP 的方法,可为研究污泥中FQs 的迁移转化及降解去除提供基础和支撑[3,15-16].

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所使用的污泥采自宁波市江东北区污水处理厂.该污水处理厂污水处理工程采用A2O 工艺,日处理能力10 万t.污泥取自二沉池,采回实验室后经24 目筛除去悬浮物及固体杂质后,冷冻干燥并研磨,避光保存于干燥器中.除特殊说明,文中所用的溶剂均为色谱级.

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

分别称取2.5 mg OFL、NOR、CIP 标准品(中检所),采用2 mL 0.1 mol·L-1盐酸溶解,甲醇定容于25 mL 棕色容量瓶中,即为100 mg·L-1标准贮备液,于4 ℃避光保存.

1.2.2 从污泥中提取FQs

取1 g 污泥,将OFL、NOR、CIP 标准贮备液稀释为10 mg·L-1,取一定体积(0.2～1 mL)加入污泥中,震荡10 min 后避光静置24 h,保证OFL、NOR、CIP 在污泥中分配均匀.向加标和未加标的污泥中加入不同种类的提取溶剂,振荡20 min 后超声提取15 min,混合液在7 000 g 离心10 min,收集上清液.重复上述步骤,合并上清液,随后稀释至一定体积.

提取溶剂包括:(a) 20 mL 乙腈-水溶液(25:75,氨水调pH=10);(b) 4 mL 50%硝酸镁-氨水溶液(96:4);(c) 0.1 g EDTA-Na2,15 mL 乙腈-0.1 M EDTA-Mcllvaine 溶液(1:1);(d) 0.1 g EDTA-Na2,10 mL 磷酸盐溶液-乙腈混合液(1:1,pH=3).

1.2.3 固相萃取

采用Waters Oasis HLB 固相萃取小柱(500 mg,6 mL)进行固相萃取,萃取流程包括活化、进样、淋洗、洗脱4 个步骤[20].设置8 组固相萃取流程(A～H),见表1.收集的洗脱液采用氮吹或旋转蒸发进行浓缩,处理温度40～50 ℃,干燥后溶解于21.5%甲醇溶液,经0.22 μm有机膜过滤,用于液相色谱分析.

表1 不同固相萃取流程

1.2.4 液相色谱测定

采用配有荧光检测器的液相色谱仪(岛津,日本)进行FQs 质量浓度检测,选用Luna 5u C8 色谱柱(250×4.6 mm,菲罗门,美国)和Inertsil ODS-SP C18 色谱柱(5 μm,250×4.6 mm,岛津,日本),进样体积10 μL,流速1 mL·min-1,激发、发射波长278、445 nm,流动相为甲醇/水溶液,等度或梯度洗脱.梯度洗脱条件设置为:15%甲醇经7.9 min 变为21.5%甲醇,再经过10.8 min 达到30%,并保持10 min.

回收率为样品的色谱峰面积与标准溶液色谱峰面积的比值.

2 结果与讨论

2.1 固相萃取流程优化

固相萃取用于净化污泥提取液,是影响后续液相色谱检测和分析的重要环节[19].选用表1 所示的8 种不同固相萃取方法(A～H),对1 mg·L-1的OFL、NOR、CIP 标准溶液进行固相萃取,回收率如图1 所示.方法E 得到的回收率最高,OFL 的回收率为75.6%,NOR 的回收率为68.3%,CIP 的回收率为66.4%;其次依次为方法C、H、A、B、F,对应的回收率分别为56.3%～64.3%、54.3%～56.4%、25.1%～30.8%、8.9%～10.1%、0.8%～4.0%;方法D和G 对OFL、NOR、CIP 基本无回收.可见,最佳的固相萃取流程为方法E:6 mL 甲醇、6 mL 水(pH=3)活化HLB 固相萃取柱,200 mL pH=3 的样品上样,后用10 mL 水(pH=3)淋洗,6 mL 甲醇、6 mL含2%氨水的甲醇洗脱.

图1 不同萃取方法对OFL、NOR、CIP 回收率的影响

2.2 浓缩方法优化

氮吹和旋蒸是常用的有机溶剂浓缩方法.将不同质量浓度的OFL、NOR、CIP 标准溶液进行氮吹或旋蒸浓缩后,样品的回收率如图2 所示.氮吹或旋蒸浓缩均可得到较高的回收率,样品经氮吹后,回收率在81.4%～99.6%之间,经旋蒸后,回收率为92.3%～125.4%.同一浓缩方法对相同质量浓度的OFL、NOR、CIP 标准溶液的回收率基本一致,波动在±7%以内.但不同浓缩方法对样品的回收率有一定影响,旋蒸浓缩后样品的回收率整体高于氮吹浓缩,但旋蒸浓缩后部分样品回收率大于100%,故选择氮吹浓缩用于污泥中FQs 的提取纯化,这也与文献[19]中的浓缩方法一致.

图2 氮吹和旋蒸浓缩对不同质量浓度OFL、NOR、CIP回收率的影响

2.3 提取溶剂优化

不同提取溶剂(a、b、c、d)对于污泥中OFL、NOR、CIP 回收率的影响如图3 所示.

图3 不同提取溶剂对OFL、NOR、CIP 回收率的影响

溶剂d 对污泥中FQs 的提取效率最高,OFL、NOR、CIP 的回收率分别为53.4%、50.1%、48.1%.其次为溶剂c,可分别得到31.9%、31.5%、35.6%的回收率.溶剂a、b 对污泥中FQs 的提取效率较低,除了OFL在溶剂b提取时得到41.0%的回收率,其余回收率均低于20%.因此,优选溶剂d:0.1 g EDTA-Na2、10 mL 磷酸盐溶液-乙腈混合液(1:1,pH=3)进行污泥中OFL、NOR、CIP 的提取.

2.4 色谱条件优化

图4 OFL、NOR、CIP 混合溶液经色谱柱分离后的液相色谱

C8 和C18 色谱柱是在分析极性污染物过程中常用的两类反相色谱柱,其类型直接影响了样品的保留时间和选择性.以21.5%和25%甲醇为流动相对OFL、NOR、CIP 混合溶液进行等度洗脱,比较两种色谱柱对于目标化合物的分离效果,结果如图4 所示.C8 色谱柱无法有效分离OFL、NOR、CIP,3 种物质的色谱峰均出现重叠.而使用C18 色谱柱时,OFL、NOR、CIP 的色谱峰得到了有效分离,具有较好的分离效果和灵敏度,故优选C18 色谱柱用于液相色谱检测.

在对污泥提取液进行液相色谱分析时,干扰物质的存在导致色谱峰对OFL、NOR、CIP 的分离度远低于标准混合液的分离度.因梯度洗脱的分离效果通常优于等度洗脱,故采用梯度洗脱对污泥提取液中OFL、NOR、CIP 进行分离,梯度条件:15%甲醇经7.9 min 变为21.5%甲醇,再经过10.8 min达到30%,并保持10 min,结果如图5 所示.在污泥提取液的色谱图中,OFL、NOR、CIP 的色谱峰附近检测出一些杂峰,这说明在污泥样品的提取过程中,一些与OFL、NOR、CIP 性质接近的有机物也被提取出来.同时,OFL、NOR、CIP 的色谱峰与杂峰得到了有效的分离,这说明优化后的色谱条件能够满足污泥中OFL、NOR、CIP 的同时分析检测.

图5 OFL、NOR、CIP 混合溶液和污泥提取液经梯度洗脱后的液相色谱

综上,污泥中FQs 的提取和测定流程优化为:采用0.1 g EDTA-Na2、10 mL 磷酸盐溶液-乙腈混合液(1:1,pH=3)进行污泥中OFL、NOR、CIP 的提取,提取液经固相萃取进行净化,净化流程为6 mL 甲醇、6 mL 水(pH=3)活化HLB 固相萃取柱、200 mL pH=3 的提取液上样,后用10 mL 水(pH=3)淋洗,6 mL 甲醇、6 mL 含2%氨水的甲醇洗脱,洗脱液经氮吹浓缩后用于液相色谱测定;液相色谱配备C18 色谱柱,流动相为甲醇/水,流动相梯度为15%甲醇经7.9 min 变为21.5%甲醇,再经过10.8 min 达到30%,并保持10 min.

2.5 定量范围

将OFL、NOR、CIP 的标准溶液(质量浓度10～500 μg·L-1)进行液相色谱测定,绘制标准曲线,结果表明在测定的浓度范围内标准曲线线性关系良好,相关系数均高于0.99.采用10倍信噪比计算定量限,可得其值为66.7 ng·g-1DS,可满足一般污泥中OFL、NOR、CIP 的测定要求.

3 结论

通过对提取溶剂、固相萃取流程、浓缩方法、色谱条件等进行优化,得到了较优的污泥中OFL、NOR、CIP 的提取和测定方法:采用EDTA-Na2、磷酸盐溶液-乙腈混合液对污泥进行超声提取,HLB 固相萃取柱分离净化,甲醇和碱性甲醇洗脱,氮吹浓缩,液相色谱(C18 色谱柱和梯度洗脱)测定.该方法能够同时检测污泥中的OFL、NOR、CIP,具有较高的分离度和回收率.