吴秋仙

(盐城市亭湖区水产技术推广站，江苏 盐城 224001)

铁元素是大多生物体的必需元素之一，虽然地壳中铁元素的含量占第4位，但是细菌可以吸收利用的游离Fe3+浓度极低。铁离子以及铁离子与蛋白质结合，参与微生物体内DNA的合成、过氧化物的降解、生物固氮等重要的生命活动过程(张莹等，2012)。铁载体(Siderophores)是由微生物(细菌、真菌)在低铁环境中产生的一类低分子量、高亲和力的铁螯合剂，因其与许多细菌的致病性密切相关而引人注目。铁载体能与铁发生特异性的结合反应，是细菌获铁系统的重要组成部分，它能够帮助病原菌从宿主的铁结合蛋白上获得铁，通过特异性的细胞膜受体将铁转移至细胞中，并参与细菌生长与代谢(Plowman等，1994)。

目前，已报道创伤弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌等均能产生铁载体，并且对所产生铁载体的类型和结构，以及铁载体与外膜蛋白的关系进行了研究(马向东等，1999)。本文研究了黄海希瓦氏菌AP629 在不同限铁培养基中的生长情况，用CAS 检测平板对AP629 的铁载体进行定性研究，用CAS 液体培养法对AP629的铁载体进行定量研究，比较了两种培养方法铁载体的产量，摸清了铁载体产生的最佳条件，为铁载体的类型及铁载体与外膜蛋白的关系等深入研究奠定基础。

一、材料和方法

1.材料

黄海希瓦氏菌(Shewanella smarflavi)AP629分离于大连地区患“化皮病”的仿刺参，由实验室证实为病原菌，-80℃保存。黄海希瓦氏菌参考菌株KCCM41822由韩国釜庆大学疾病预防实验室赠送。CAS 检测平板：每100 毫升含20%蔗糖溶液l 毫升，10%酸水解酪素3 毫升，1 毫摩/升CaC12100 微 升，1 毫 摩/升MgSO42 毫 升，琼 脂1.8 克，在约60℃时缓慢加入盐溶液和CAS 染液各5毫升，即得蓝色检测培养基。所有溶液均用去离子水配制。按照Schwyn B等(1987)的方法配制CAS(铬天青)染液且避光保存。

2.方法

(1)不同浓度螯合剂对细菌生长的影响。将黄海希瓦氏菌AP629和参考菌株接种于海水营养琼脂(NA)上，28℃培养24 小时，将形成的细菌单菌落接种于含有2,2’－联吡啶浓度为0、25、50、75、100、150、200、250、300 微摩/升的LB 和TSB 培养基中，28℃振荡(180 转/分)培养24 小时，用分光光度计测波长600纳米处的吸光值。

(2)铁载体的检测。CAS 蓝色染液是由络天青、溴化十六碳烷基三甲铵和铁离子组成的一种复合物，呈亮蓝色。当细菌产生铁载体时，这种物质会结合CAS 染液中的铁离子，使其从CAS 蓝色复合物中解离出来，失去铁离子的CAS蓝色检测液的颜色会变为橘黄色。由于颜色变化，630纳米光密度变小，故铁载体的量可通过CAS 比值来表示(马国文等，1999)。CAS 比值：(对照－测量)/对照。对照组为未加螯合剂2,2’－联吡啶、未加细菌的LB、TSB 培养基。测量组为加不同浓度螯合剂2,2’－联吡啶及细菌的LB、TSB培养基。

(3)CAS 检测平板上的定性检测。将黄海希瓦氏菌AP629、参考菌株KCCM41822 以及大肠杆菌等参考菌株，用TSA(胰蛋白胨大豆琼脂)培养基培养，接种后于28℃下培养24～48 小时；用三角刮刀将菌体刮下，PBS 重悬，并稀释成5×106细胞/毫升菌液。取20 微升滴至CAS 检测平板上，28℃下培养24 小时。在菌落的周围固体平板由原来的亮蓝色变为橙色，这种典型的颜色改变即是铁载体分泌圈(Sohwyn B等，1987)。

(4)液体培养基中铁载体的定量检测。菌株上清液中铁载体的检测参考高磊等(2007)的方法进行。取培养获得的黄海希瓦氏菌AP629和参考菌株KCCM41822 的菌悬液，12 000 转/分离心10 分钟，提取上清液与等量的CAS 染液混合，静置数分钟，用分光光度计测波长630纳米处的吸光值。

二、结果与分析

1.不同浓度螯合剂对细菌生长的影响

黄海希瓦氏菌在TSB、LB 中限铁生长见图1、图2。在TSB 培养基中两株菌随着2,2’－联吡啶浓度的渐增先迅速上升，后逐渐下降，两株菌在2,2’－联吡啶浓度为25微摩/升时均生长最旺盛，当2,2’－联吡啶的浓度达到300 微摩/升时，黄海希瓦氏菌AP629 和参考菌株KCCM41822 几乎不生长。在LB 培养基中，两株菌的生长量低于TSB 中的生长量，随着2,2’－联吡啶浓度的渐增，生长量逐渐降低，黄海希瓦氏菌AP629 和参考菌株KCCM41822 在2,2’－联吡啶浓度为50、100 微摩/升时均生长最旺盛，当2,2’－联吡啶的浓度达到300 微摩/升时，黄海希瓦氏菌AP629 和参考菌株KCCM41822几乎不生长。菌株在加入一定浓度的螯合剂后，会促进它的生长。

图1 黄海希瓦氏菌在TSB中限铁生长

图2 黄海希瓦氏菌在LB中限铁生长

2.铁载体的检测

(1)CAS 检测平板上的定性检测。结果表明，在菌落的周围固体平板由亮蓝色变为橙色，这种典型的颜色改变即是铁载体分泌圈所致。从图3A(1-2，3-4)可以看出，黄海希瓦氏菌AP629和参考菌株菌落的周围变成橙色，表明两株菌能够产生铁载体；图3B(1-2)大肠杆菌菌落周围的橙色较大，说明分泌的铁载体较多。从图3C(3-4)可见，假单胞菌在CAS 检测平板上不能生长；从图3C、图3D 可见，溶藻弧菌和嗜水气单胞菌较迟钝爱德华氏菌的铁载体分泌圈稍小。

图3 不同菌株铁载体形成能力比较

(2)液体培养基中铁载体的定量检测。铁载体的产生是通过蓝色染液的颜色变化来观察的。本试验用TSB培养基发现不同浓度螯合剂对培养基的颜色产生了影响，使培养基的颜色略微呈现橘黄色，如图4 所示，干扰了结果的观察，因此，TSB不宜作为检测铁载体的培养基。

图4 不同浓度2,2’－联吡啶TSB上清液中铁载体检测

两株菌在LB 培养基上清液中分泌的铁载体产量如图5所示。AP629在2,2’－联吡啶浓度为50微摩/升时铁载体产量最高，参考菌株在100微摩/升时铁载体产量最高。

图5 LB培养基中铁载体检测

三、讨论

本文研究了不同浓度螯合剂2,2’－联吡啶对黄海希瓦氏菌AP629和参考菌株生长以及铁载体产生的影响。结果表明，培养基中加入2,2’－联吡啶后螯合了环境中的铁，细菌若没有产生铁载体其生长量必然减少，而试验结果细菌数量反而增加，说明了黄海希瓦氏菌AP629和参考菌株为了在限铁环境中生存，已经产生了铁载体，以利于自身的生长。在TSB 培养基中，黄海希瓦氏菌AP629和参考菌株的产铁载体的界限浓度都是50微摩/升；在LB培养基中，两株菌的产铁载体的界限浓度分别是100、200微摩/升。当环境中铁离子浓度越高，越能通过非特异性系统摄取铁营养，而只有在铁营养不足时，细菌才合成铁载体来摄取铁。这些现象说明在黄海希瓦氏菌的生长中，铁这一营养因素扮演了重要的角色。

本文采用了Sohwyn B 等(1987)的固体平板检测法来检测菌株的产铁载体的能力。结果表明，黄海希瓦氏菌AP629 和参考菌株能够产生铁载体；大肠杆菌菌落周围的橙色圈较大，从而得出其能分泌较多的铁载体；假单胞菌在CAS检测平板上不能生长，可能是合成铁载体量较少的细菌由于体系中的Fe3+受到更强的限制，从而生长受到抑制；溶藻弧菌和嗜水气单胞菌较迟钝爱德华氏菌的铁载体分泌圈稍小。本文结果表明，不同菌种对于铁离子浓度的要求是有差异的，产生铁载体的能力也是有所不同的。

在对两株菌进行液体培养基检测时发现，TSB不宜作为检测铁载体的培养基，本试验采用了LB培养基。检测黄海希瓦氏菌AP629 和参考菌株KCCM41822在LB培养基上清液中的铁载体含量，结果表明，黄海希瓦氏菌AP629在2,2’－联吡啶浓度为50 微摩/升时铁载体产量最高，参考菌株KCCM41822在100微摩/升时铁载体产量最高。