邓秘 龙霖梓 谭令 黄明艳 曲华 付长庚

活血解毒中药配伍由赤芍、川芎、黄连三味中药组成，该配伍在临床上广泛用于改善冠心病的临床症状及预后[1]。课题组前期通过实验证明活血解毒中药配伍可通过抑制炎症反应、增强超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性等途径改善大鼠心功能[2-4]，但对急性心肌梗死后冠脉无复流的研究尚未涉足。故本研究采用缺血再灌注方法制备大鼠冠脉无复流模型，观察活血解毒中药配伍通过调控心肌细胞过度自噬，减轻无复流心肌损伤的作用机制，以期为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康Wistar大鼠，雄性，SPF级，体质量200～220 g(购自常州卡文斯，动物许可证号码：SCXK(苏)2016-0010)，共96只，饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级动物房，白夜交替时间为12小时，标准饲料喂养，自由取食及饮水。

1.2 实验药物

活血解毒中药组成为川芎10 g、赤芍10 g、黄连10 g，由江阴天江药业有限公司制备成颗粒，然后以生理盐水配制，高压灭菌后于-20 ℃条件下贮存；阿司匹林肠溶片(沈阳奥吉娜药业有限公司提供，批号：151001，规格：100 mg/片)。

1.3 主要试剂及仪器

氯化硝基四氮唑蓝(国药集团，298-83-9)、硫黄素S(源叶生物，1326-12-1)、透射电子显微镜(JEOL，JEM1230)、激光共聚焦显微镜(Nikon，C2)、全自动生化分析仪(OL YMPUS，AU-400)、PCR仪(东胜创新生物科技有限公司，EDC-810)、水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，JY300)、抗自噬效应蛋白Beclin-1抗体(abcam，ab62557)、抗B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl 2)抗体(abcam，ab196495)、抗微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)抗体(CST，12741)。

1.4 实验分组及给药方法

将96只大鼠随机分为6组，包括假手术组(Sham组)、冠脉无复流模型组(I/R组)、活血解毒中药低剂量组、活血解毒中药中剂量组、活血解毒中药高剂量组和阳性药物对照组，每组16只。假手术组及冠脉无复流模型组给予等体积生理盐水灌胃；活血解毒中药低剂量组[270 mg/(kg·d)]、中剂量组[540 mg/(kg·d)]、高剂量组[1080 mg/(kg·d)]给予等体积活血解毒中药灌胃；阳性药物对照组给予阿司匹林30 mg/(kg·d)等体积灌胃，连续灌胃14天。

1.5 冠脉无复流模型的制备

采用缺血再灌注方法制备冠脉无复流模型[5]。经药物灌胃干预14天后，按10 mL/kg的剂量腹腔注射3.5%水合氯醛进行大鼠麻醉，从左侧第4、5肋间打开胸腔，快速取出心脏并于左心耳下2 mm将冠状动脉左前降支钝性分离，用0号手术线结扎，然后将心脏放回胸腔，以动脉夹夹闭切口，假手术动物只穿线不结扎。结扎4小时后剪断硅胶管，实施再灌注8小时，建立大鼠冠脉无复流模型。

1.6 血清CK-MB和cTnT的含量测定

每组大鼠进行腹主动脉取血并分离血清，采用7020型全自动生化仪测定血清肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase-MB，CK-MB)和肌钙蛋白 T(cardiac troponin T，cTnT)的含量。

1.7 心肌梗死面积及无复流面积测定

再灌注结束后，每组随机选择8只大鼠并处死，取出心脏称重后均匀地将心室部分切成等厚5片，置于0.2%硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium, N-BT)染液中染色2～3分钟；用扫描仪扫描心肌获得扫描图像，测量每片心肌双侧的梗死区(N-BT非染色区，呈灰白色)和非梗死区(N-BT染色区，呈蓝黑色)面积，计算梗死区面积占全心面积的百分比。将剩下的8只大鼠，自股静脉注射6% 硫磺素 S(1 mL/kg)后处死，迅速取出心脏，称质量后均匀地将心室部分切成等厚5片，分别称质量后将心脏切片置于薄层色谱仪的暗箱中，于 365 nm波长光源下，观察荧光并用相机拍照，用多媒体彩色病理图像分析系统测量每片心肌双侧的无复流区(硫磺素不着色，呈暗黑色)和复流区(硫磺素着色，呈明亮的蓝绿色)，计算无复流区占全心面积的百分比。

1.8 Q-PCR检测Beclin-1、Bcl 2、LC3 mRNA的表达

取大鼠无复流心肌组织，用Trizol法提取细胞总RNA并定量。采用ABI7500 Fast PCR仪进行PCR扩增，具体反应体系：cDNA模板 1.0 μL、2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL、上游引物0.8 μL、下游引物 0.8 μL、50×Rox Dye Ⅱ 0.4 μL、DEPC水7.0 μL，混匀。扩增条件为 95℃预变性30秒，95℃变性3秒，60℃退火15秒，循环40次。β-actin作为内参对照，上机进行扩增，实验结束后分析整理数据。引用序列具体见表1。

1.9 Western blot检测Beclin-1、Bcl 2、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达

取出大鼠无复流心肌组织，加入PMSF单去污剂裂解液进行匀浆，4 ℃，12000 rpm离心5分钟，取上清分装。BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量后，加入上样蛋白缓冲液100℃沸水浴10分钟。蛋白变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜；用含5%脱脂奶粉的TBS-T(Tris-HCl 20 mM，NaCl 137 mM，0.1% Tween-20)封闭2小时；加入LC3、Beclin-1、Bcl 2一抗(稀释倍数1∶1000)，在 4℃震荡过夜。用TBS-T洗涤后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释倍数1∶2500)孵育、洗涤后，加入ECL 发光液，用凝胶成像系统扫描并进行数据分析。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 活血解毒中药配伍对大鼠血清学心肌损伤标志物的影响

与假手术组比较，冠脉无复流模型组大鼠血清CK-MB及cTnT显著升高(P<0.01)，提示模型制备成功；相较于冠脉无复流模型组，活血解毒中药低、中、高剂量组大鼠经过缺血再灌注后血清CK-MB和cTnT均降低(P<0.01)，且以中剂量组效果最佳，表明活血解毒中药能减轻无复流导致的心肌损伤。见表2。

2.2 活血解毒中药配伍对大鼠心肌梗死面积及无复流区域面积的影响

相较于假手术组，冠脉无复流模型组及药物处理组大鼠心肌梗死面积及无复流区域面积均显著增加(P<0.01)；与冠脉无复流模型组大鼠相比较，活血解毒中药不同剂量组大鼠心肌梗死面积和无复流区域面积均显著减少(P<0.01)，且中药中高剂量组较低剂量组更为显著(P<0.01)，表明活血解毒中药能有效减少大鼠缺血再灌注损伤所导致的心肌梗死面积和冠脉无复流区域面积。见表3。

表1 引物序列如下表所示

表2 各组大鼠血清CK-MB、cTnT水平比较

表3 各组大鼠心肌梗死面积及心肌 无复流区面积比较

2.3 活血解毒中药对缺血再灌注大鼠心肌自噬相关基因表达的影响

与冠脉无复流模型组大鼠相比较，活血解毒中药不同剂量组大鼠经过缺血再灌注后心肌自噬相关基因Beclin-1、LC3II/I表达降低，Bcl 2表达增加(P<0.01)，并且以中高剂量组抑制心肌细胞自噬效果最佳，表明活血解毒中药能够调控心肌细胞自噬相关基因的表达，对无复流区域心肌细胞的过度自噬起抑制作用。见表4。

表4 各组大鼠心肌无复流区域Beclin-1、 LC3II/I及Bcl 2基因表达的比较

2.4 活血解毒中药对缺血再灌注大鼠心肌自噬相关蛋白表达的影响

与冠脉无复流模型组大鼠相比较，活血解毒中药低、中、高剂量组大鼠自噬正相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低(P<0.01)，自噬负相关蛋白Bcl 2表达显著升高(P<0.01)，表明活血解毒中药可抑制大鼠无复流区域心肌细胞的过度自噬。见图1。

注：①假手术组；②冠脉无复流模型组；③中药低剂量组；④中药中剂量组；⑤中药高剂量组；⑥阿司匹林组。

3 讨论

冠状动脉无复流(coronary artery no-reflow, CNR)是指经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention, PCI)治疗后，相关罪犯血管实现再通，但心肌组织仍存在无灌注或灌注不良的现象[6]。无复流现象在择期PCI术后的发生率约为 1%～5%，急诊PCI中的发生率可高达25%～40%[7]。Nair等[8-9]研究发现，相较于PCI术后血流正常组，无复流患者严重心律失常、心力衰竭和住院死亡率的发生率均显著升高，严重降低了患者的临床获益。因此，如何有效预防冠脉无复流的发生是当前临床面临的难题。新近研究表明冠脉无复流现象与心肌细胞的自噬与凋亡、炎症反应、氧化应激、心脏微循环障碍等因素相关[10-11]。Mehrdad等[12-13]发现急性心肌梗死实现血管再通后会导致心肌细胞过度自噬，从而加重心肌损伤，而抑制心肌自噬活性则会减轻缺血再灌注损伤，达到保护心肌组织的目的[14-15]。因此，通过调控心肌细胞自噬防治冠脉无复流可能是减轻冠心病介入治疗围手术期心肌损伤的治疗方法之一[16-17]。

自噬相关基因(Atg)调控自噬，其中Atg8(LC3)和Atg6(beclin-1)是调控自噬的重要基因。Beclin-1能与Vps34结合参与自噬体的形成和成熟，是正向调控自噬的重要因子。LC3有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ两个亚型，当自噬激活时，水溶性LC3Ⅰ转化为自噬囊泡相关型LC3Ⅱ,参与后期自噬体的合成[18-19]。因此，测定LC3Ⅱ/Ⅰ的比值能代表自噬的变化，当LC3Ⅱ/Ⅰ升高时表示自噬活性增强，反之则表示自噬受到抑制。此外，由于自噬和凋亡之间存在相同的信号通路，凋亡相关蛋白Bcl 2通过负向调节Beclin-1，从而抑制自噬活性[20]。在本研究中，课题组发现相较于冠脉无复流模型组，经活血解毒中药预处理后自噬正相关基因Beclin-1、LC3Ⅱ表达降低，自噬负调节基因Bcl 2表达升高，与崔建坤等[21]通过制备大鼠心肌缺血再灌注模型，探讨去甲氧姜黄素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用结果一致。

冠状动脉无复流导致的心肌损伤，根据其病机特点应归属于传统医学“胸痹”“心痛”的范畴。本研究中活血解毒中药配伍源于国家中医心血管病临床医学研究中心治疗冠心病的经验效方——愈梗通瘀汤。赤芍、川芎、黄连三味中药配伍高度契合冠心病“毒瘀搏结、痹阻心脉”的病机。黄连最早记录于《神农本草经》中，有清热燥湿、泻火解毒的作用。现代药理学研究提示，黄连素能通过抑制血栓素、前列环素的合成等途径抗血小板聚集[22]。川芎具有活血行气、祛风止痛的功效。现代研究发现川芎嗪、藁本内酯等有效成分，具有抗血栓形成及抗血小板聚集的作用[23]。赤芍有清热凉血、散瘀止痛的功效。现代药理研究发现赤芍总苷具有抗凝血及抗血栓作用[24]。因此，上述三味活血解毒中药配伍可通过多途径、多靶点改善缺血性心肌损伤，达到保护心功能的目的。

综上，课题组认为活血解毒中药配伍能降低冠脉无复流损伤大鼠血清 CK-MB、cTnT水平，减少心肌无复流面积，其机制与抑制大鼠心肌细胞过度自噬相关。