李润康，何洪源*，李佳宜，张云峰，任昕昕

(1.中国人民公安大学 侦查学院，北京 100038；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038)

γ-羟基丁酸(γ-Hydroxybutyrate，GHB)是存在于大多数哺乳动物体内的一种内源性物质，由抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)降解产生(图1)[1]，能够刺激荷尔蒙分泌，增加快感，产生肌肉放松和遗忘效应[2]。虽然GHB的钠盐可用于发作性睡病相关的猝倒和酗酒者解毒、戒断的治疗，但犯罪分子常利用GHB无色、无味且不易观察等特性，将其作为迷奸药物投放到饮料中，待受害者服用失去意识后实施性侵[3]，对社会造成极大危害，需引起广泛关注。目前未见有关生物样品中GHB的检验方法和阈值的全面综述性研究报道。本文对GHB的性质与应用、体内代谢和转化进行了概述，重点综述了生物样品中GHB的前处理方法、检测方法和阈值的最新研究进展，讨论了GHB在未来法庭科学中的研究趋势，以期为GHB相关案件提供参考，帮助结果的科学判定。

1 GHB概述

1.1 GHB的性质与应用

GHB于1960年被首次发现，具有与GABA相似的药理特性，能够穿过血-脑屏障产生抑制效应[4]，早期用作麻醉辅助剂，对诱导深睡眠和痛觉缺失有较好的效果[5]。后因GHB的镇痛作用较弱，不易推断出麻醉的剂量，且可能产生严重的副作用而被其他药物取代[6]。有些健美爱好者通过服用GHB来增强肌肉、辅助减肥、提高代谢，但用药后身体机能出现问题。20世纪80年代初，人们发现GHB及其前体物质有一定提升情绪的作用，并将其用于娱乐活动中，由于GHB具有陡峭的剂量-反应曲线，由此产生了许多因药物过量而致死的案件[7]。20世纪90年代以来，GHB引发的药物辅助性侵犯事件(Drug facilitated sexual assault，DFSA)越来越多，我国于2001年5月将其列为二类精神药物进行列管[8]。

1.2 GHB的体内代谢及转化

GHB在体内的代谢和排出非常迅速，口服15～30 min后即可发挥效应，持续时间可达6 h，在8～12 h内，尿液和血液中GHB的浓度可降至内源性水平。95%以上的GHB通过一系列酶进行肝代谢，通过GHB脱氢酶氧化生成琥珀酸半醛(Succinic semialdehyde,SSA)，再进一步经过琥珀酸半醛脱氢酶氧化生成琥珀酸，最终通过三羧酸循环生成二氧化碳和水，5%以下的GHB经尿液排出[9](图1)。

在实际案例和研究中发现，虽然GHB已被很多国家列管[8,10]，但其前体物质γ-丁内酯(γ-Butyrolactone，GBL)和1,4-丁二醇(1,4-Butanediol，1,4-BD)无法律限制，两者均能在体内迅速转化为GHB发挥活性作用。GBL可通过钙依赖性内酯酶转化为GHB，或在碱性条件下，通过水解转化为GHB；在酸性条件下，GHB可以通过分子内酯化反应逆转化为GBL[11]。1,4-BD则通过乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)转化为γ-羟基丁醛(gamma-Hydroxybutyraldehyde)，再通过乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH)最终转化为GHB[12](图1)。

2 生物样品中GHB的检验

2.1 生物样品中GHB的前处理方法

目前，生物样品中GHB的前处理方法有沉淀蛋白法、液液萃取法、固相萃取/固相微萃取法、分子内酯化法和衍生化法等。

2.1.1 沉淀蛋白法Shima等[13]在提取尿液中的GHB时，对比了液液萃取、固相萃取和沉淀蛋白法的效果，发现沉淀蛋白法对GHB的提取效率最高，具有良好的色谱分析效果。根据所用的沉淀剂不同，沉淀蛋白法可分为有机溶剂、酸和盐析沉淀蛋白3种方法。其中乙腈[14]、甲醇[13]、丙酮[15]和水-甲醇(3∶97，体积比)[16]等有机溶剂最为常见。Meyer等[17]将乙腈用于尿液和血浆沉淀蛋白，取上清液与二甲基甲酰胺、衍生化试剂双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)混合进行衍生化，方法快速简便。Bosman等[18]在血浆中加入冷高氯酸，一次性完成了沉淀蛋白和GHB的内酯化。有机溶剂和酸也可同时用于沉淀蛋白以提高GHB的回收率。Johansen等[19]将酸化甲醇用于全血的沉淀蛋白，GHB的提取效率在92%以上，方法简单且重现性好。此外，无水硫酸钠也可作为各种生物体液沉淀蛋白的盐析剂[20]。GHB是一种与蛋白质结合较低的化合物，采用沉淀蛋白法可去除血液或血浆中存在的各种基质干扰，如血细胞、蛋白质和脂质等，是一种简单可行的前处理方法。

2.1.2 液液萃取法液液萃取法是生物样品中GHB提取的常用前处理方法，常见的萃取溶剂有乙酸乙酯、乙腈、叔丁基甲醚和正己烷等。GHB的物理性质给液液萃取法直接提取增加了难度，研究人员尝试采用多种方法提高GHB在有机相中的溶解度，以提高回收率。如选择不同萃取溶剂、pH值和盐析剂，以将基质中的GHB转化为不带电的中性分子，促进GHB从水相向有机相的转移，从而获得最佳的萃取效率和选择性。De Paoli等[21]在提取唾液样品中的GHB时，通过加入1 mL饱和氯化铵缓冲液调节pH值，以乙酸乙酯为萃取溶剂，将唾液中的GHB萃取到有机溶剂中进行分析。加入饱和氯化铵缓冲液或氯化钠(固态盐)等盐析剂可以增加水相的离子强度，改变水溶性分析物在两种不相容溶剂间的分配比。此外，在尿液、血清和血液中加入盐酸或硫酸既能降低GHB羧酸基团的电离，也可促进GHB向有机层转移[22]。

生物样品中的GHB也可内酯化为GBL后进行液液萃取，常用的萃取溶剂有二氯甲烷、氯仿和苯[23-25]。在酸性条件下转化生成的GBL会发生质子化，从而以离子的形式游离在水相中，对液液萃取不利。可通过向溶液中加入氯化钠盐析剂，或添加磷酸盐缓冲液或氢氧化钠中和酸性溶液的方法提高GBL的回收率。液液萃取后，通常对混合物进行离心，转移上清液，随后蒸发浓缩，但不能完全蒸干，这是因为GBL极易挥发，在蒸发至干燥的过程中会大量丢失。Ferrara等[26]在提取血浆和尿液中的GHB时，分别向其中加入冷高氯酸和盐酸酸化，取上清液在80 ℃下加热20 min，将GHB转化为内酯形式的GBL，并加入苯进行液液萃取，随后取血浆和尿液离心后的有机层在35 ℃的水浴和低氮气流量下浓缩至最终体积0.2 mL，避免了GBL的过度损失。

液液萃取法是实验室的常规前处理方法，萃取量大，但选择性较差、富集因子低，需要结合加热、离心、吹干浓缩等过程，增加了时间和劳动成本。

2.1.3 固相萃取/固相微萃取法阴离子交换固相萃取是生物样品中GHB的常用固相萃取法，其遵循传统固相萃取的步骤，即活化、上样、淋洗和洗脱。中性条件下，GHB的羧基带负电荷，能被带正电的吸附剂吸附。故萃取过程中，与固体基质结合的有机部分或季铵物质在整个pH值范围内应保持正电荷，以实现与不同pH值下GHB的相互作用。使用酸性溶剂可使GHB更易被洗脱下来[27]。Elian等[28]在提取尿液中的GHB时，采用阴离子交换柱进行固相萃取，用去离子水和甲醇活化小柱，以含有冰醋酸的甲醇作为溶剂，从固相萃取柱中洗脱GHB，收集洗脱液，蒸发至干燥，流动相复溶后分析，GHB的回收率大于75%。此外，固相萃取柱还可将干扰物质保留在柱上，降低对GHB测定的干扰。Sørensen等[29]采用CX固相萃取柱净化GHB全血提取溶液中的干扰物质，洗脱液与乙腈混合后转入小瓶中进行分析，这种附加的净化方式改善了GHB的峰形，降低了基线噪声。

作为传统固相萃取的改进技术，固相微萃取(SPME)也已经应用于尿液中GHB的提取。Brown等[30]采用SPME法提取人尿中的GHB时，对萃取时间、萃取温度和解吸时间、解吸温度进行优化，获得的最佳固相微萃取参数为90 ℃下萃取20 min，在225 ℃的GC进样器中解吸1 min。该方法无需多步操作和过量使用有机溶剂，可直接将涂有固定相的熔融石英纤维放置在样品中吸附目标分析物。与沉淀蛋白法或液液萃取法相比，固相萃取/固相微萃取法可以精准、方便地提取GHB，回收率更高，易实现自动化与高通量，适用于大样本检测，但特制的固相萃取小柱通常十分昂贵，成本高。

2.2 生物样品中GHB的检测方法

生物样品中GHB的检测方法主要有化学显色法(Chemical chromogenic)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等，详见表1。

表1 生物样品中GHB的检测方法Table 1 Detection methods for determination of GHB in biological sample

2.2.2 气相色谱-质谱法GC-MS法是GHB最为常用的检测方法，其操作简单，维护成本较低，检出限达0.1 mg/L，可满足血液、尿液等常见基质中内源性GHB的检测要求(μg/mL)。GHB在分析前可进行两种方式的化学修饰，一是在酸性条件下进行内酯化反应；二是与衍生化试剂进行衍生化反应，见图2。由于衍生化反应增加了分析物的分子量，降低了其极性，从而可提高挥发性和分离效率，进而提高方法的灵敏度和选择性[40]。Küting等[41]采用GC-MS法检测死后生物体液和组织中的GHB，通过沉淀蛋白法提取目标物，以甲醇为沉淀剂，经双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，含1%三甲基氯硅烷(TMCs))衍生化后分析，GC-MS总运行时间为11.98 min，方法的检出限为0.12 mg/L，定量限为0.41 mg/L，精密度小于15%。

图2 GHB的两种化学修饰方式(R1、R2泛指对应生成的基团)Fig.2 Two chemical modification strategies of GHB(R1 and R2 are the groups that are formed)

2.2.3 气相色谱-串联质谱法GC-MS/MS法能够监测目标化合物的特定母离子与产物离子，结合衍生化反应，可使方法的选择性和灵敏度得到大大提高，这对浓度检测要求更高的毛发分析十分有利。在对血液、尿液等基质的分析中，GC-MS/MS法可以改善峰形，极大地降低背景干扰，稳定性强，比GC-MS法更具优势。Meng等[42]建立了头发中GHB的分散液液微萃取(DLLME)结合GC-MS/MS的检测方法，以GHB-D6为内标，加入磷酸二氢铵至饱和，调pH值至4.3，用乙酸乙酯分散液液提取，经BSTFA衍生化后分析，头发中GHB的最低检出限为0.01 ng/mg，样品加标回收率为70.6%～88.5%，相对标准偏差小于4.9%。

2.2.4 液相色谱-串联质谱法LC-MS/MS法具有高灵敏度、精确性和特异性，已经成为GHB临床和司法鉴定领域的重要检测技术[43]。尤其在某些案件中GHB及其前体物质可能同时存在，仅用GC-MS、GC-MS/MS法难以一次性完成全部物质的检测。而LC-MS/MS法可以通过等度或梯度洗脱程序，在更短的运行时间内同时实现GHB及其前体物质GBL和1,4-BD的分离，在办案中更具实用价值。施妍等[44]建立了尿液中GHB与其前体物质1,4-BD、GBL的LC-MS/MS检测法，以GHB-D6、吗啡(MOR)-D3为内标，尿样经甲醇沉淀蛋白后分析。结果显示，GHB、1，4-BD和GBL的检出限分别为0.1、0.1、2 mg/L，准确度为87.6%～98.1%，日内及日间精密度均小于15%。

3 生物样品中GHB阈值研究

GHB是小分子物质，存在于大脑、心脏、肝脏、肾脏、肌肉中[45]，其浓度在一定范围内波动。GHB在体内消除的半衰期短，外部摄入的GHB将很快回到内源性水平。血中GHB的检出时限约5 h，尿中的检出时限约12 h，长期使用无药物蓄积现象，这使得GHB的检测窗口期窄，对外部摄入和内源产生的GHB不易辨别。研究发现，人机体死亡后，检材中GHB的浓度会升高，Elliott等[5]认为这是腐败和微生物同时起了作用，而Moriya等[46]认为死亡后细菌的糖酵解导致了GHB的增加。在法庭科学研究中，多种因素会影响检材中GHB浓度的变化。这就更加难以判定人体是否摄入过GHB，而且无法准确定量。基于上述特点，在生物样品中，如何区分外部摄入和内源产生(包括死后产生)的GHB的阈值(cut-off)以及阈值的数据积累已经成为研究的热点问题。

3.1 血液中GHB阈值的研究

有报道称死后股静脉血或心血等血液样品中外部摄入与内源产生的GHB浓度的阈值为50 mg/L[47]。Kintz等[48]检测了71例无GHB摄入的案例，死亡与尸检之间的时间间隔从12 h到72 h不等，结果在71例检材血中均检出GHB，浓度范围为0.4～409 mg/L，主要分布在10～40 mg/L范围内，其中有14例浓度超过50 mg/L，这可能是个体差异或者死后形成的。Korb等[49]对387名死者(男273，女114，无GHB摄入)血中GHB的浓度进行检测，未检出或者检出<10 mg/L的占比18%(68例)，检出10～50 mg/L的占比为73%(283例)，检出51～193 mg/L的占比为9%(36例)。虽然仍有9%的样本中GHB浓度≥51 mg/L，但是GHB未检出或检出<50 mg/L的比例高达91%，这在一定程度上支持了50 mg/L作为死后GHB的阈值浓度。后来许多研究者试图通过大量死后样本(生前无GHB摄入)的检测来获取血液中GHB的浓度水平，这些数据为阈值的确立提供了重要参考。如Castro等[50]评估了32名无GHB摄入死者全血中GHB的浓度水平，死亡和尸检之间的时间间隔均在5 d以内，结果发现所有案例中GHB的浓度值呈正态分布且检出量均低于30 mg/L，浓度范围在1.82～22.60 mg/L之间，平均值为8.43 mg/L，中位数为7.06 mg/L。Ha等[51]检测了348例无GHB摄入死者心脏血GHB的浓度水平，其中仅有39例检测出GHB，浓度范围在10.4～62.16 mg/L之间，中位数为22.45 mg/L。也有研究探讨了活体血中GHB的浓度水平，如Busardò等[52]测定了20名无GHB摄入史的哺乳期妇女血液中GHB的内源性浓度水平，其浓度范围在0.21～1.52 mg/L之间，平均值为0.57 mg/L。Liakoni等[53]对16名受试者口服GHB(50 mg/kg) 1 h和3 h后的血液样本进行测定，结果显示1 h和3 h后血液中GHB浓度的中位数分别为83.1 mg/L(范围为54～110 mg/L)和24.4 mg/L(范围为7.2～49.7 mg/L)。以上数据说明，死后样品与活体样品中GHB的浓度范围有一定的重叠，但两者之间的阈值判定仍有较大的不同。此外，死后血液样品的腐败极易干扰结果的判定。

3.2 尿液中GHB阈值的研究

国际毒理学会(IUTOX)建议尿液中GHB浓度的阈值为10 mg/L。刘晓茜等[6]测定了121名中国健康志愿者尿液中内源性GHB的浓度，平均值为0.2 mg/L，最大值为1.9 mg/L，作者认为该结果佐证了阈值为10 mg/L的可行性。Andresen等[54]测定了50名无GHB摄入人员的尿样，50份尿样中内源性GHB的浓度范围为0.64～4.20 mg/L，平均值为1.21 mg/L，中位数为0.96 mg/L。基于这些数据，作者建议尿中GHB浓度的阈值应从10 mg/L降至6 mg/L，以避免出现假阴性结果。

施妍等[44]分析了40名无GHB摄入的志愿者尿液样本，尿液中GHB的浓度为(1.35±0.74)mg/L。Jarsiah等[34]测定了132名无GHB摄入志愿者尿液中的GHB，结果发现其内源性浓度范围为0.03～1.94 mg/L。这两个结果均小于6 mg/L，远低于上述建议的两种阈值。而从GHB摄入的角度来看，Küting等[41]报道了一例40岁GHB中毒致死的男性病例，该病例在死前约5 h摄入含GHB的饮料，其死后尿液中GHB的浓度为864 mg/L，该数据远高于上述阈值，支持GHB过量致死的结论。Darke等[55]报道了26例因GHB摄入致死的病例尿液中GHB的浓度，其中位数为297 mg/L，浓度范围为8～6 176 mg/L，范围跨度极大，最大值与中位数之间相差20倍以上，但所有浓度值均高于8 mg/L，也支持上述阈值为6 mg/L。但Mari等[56]对比无GHB摄入的志愿者和酗酒者时，发现服用GHB作为酒精戒断治疗药物的30例酗酒者中，有36.6%的患者尿液中GHB浓度范围为2.75～7.80 mg/L，显著低于上述阈值，造成了相当比例的假阴性结果。尽管不同研究者检测出的数据存在一些差异，但大多数尿液中内源性GHB的浓度都在10 mg/L以内[34,54]，争议相对较小，有统一的国际建议阈值。与血液样品相比，尿液中杂质较少，在前处理、检出时限、结果判定中有着巨大的优势。故在实际办案过程中应尽可能地将尿液样本作为首选，有利于排除干扰，综合研判。

4 展 望

目前，生物样品中GHB的检验有多种前处理和测定方法，但这些方法在GHB定量时大多回避了基质样品中存在内源性分析物的事实。GHB的定量方法主要包括：使用模拟基质或分析物进行测定、采用标准添加法测定及忽略足够小的内源性浓度进行直接测定，所选择的方法对分析的准确性和分析效率有很大影响。今后，开发更加高效、简单和准确的方法，解决内源性物质的干扰问题将是研究者的重要任务。

法庭科学面临的挑战不仅是要尽可能精确地测定生物样品中GHB的浓度，还要对检测结果给出正确的解释，以便能够区分外部摄入与内源性GHB。大量研究提示我们仅仅依靠单一的阈值去判断机体是否摄入过GHB是不完全准确的，但文献中建议的阈值仍有很大的参考价值。笔者认为相对准确的GHB浓度阈值是年龄、性别、病史、饮酒史、吸毒史、是否死亡、死因、死后间隔时间、法医解剖的腐蚀变质程度等多种变量作用的结果，应尽可能地扩大样本量，建立与GHB相关联的数据库，才能更接近“真实的”阈值范围。此外，在疑似GHB摄入致死的相关案件中，对不同基质(血液、尿液)的分析有助于结果的正确解释，而对于替代性基质(如唾液、汗液、玻璃体液、头发等)的分析是否有可能提供比常规基质更有价值的信息，还需要进一步的研究。

总之，GHB所引起的广泛关注和尚未解决的种种问题为法庭科学的发展提出了实际要求，研究人员还需积累案例数据，发现规律，将系统性和科学性融入GHB的检测和解释中，为法医毒物的研究提供基础支撑，为更好地侦破、打击该类毒品犯罪提供科学依据。