王申仪 阳军

(湖南师范大学第一附属医院心血管内科，湖南 长沙 410005)

尽管在过去几十年中，动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的死亡率和发病率已显著降低，但ASCVD仍是全球范围内主要的死亡原因[1]。中国ASCVD患病率现处于持续上升阶段[2]，而低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高是动脉粥样硬化发生和发展最重要的危险因素[3]，他汀类药物作为降低LDL-C的国际一线治疗药物，具有充分的证据证明其疗效和安全性[4]。然而，反调节效应限制了他汀类药物降低低密度脂蛋白(LDL)的能力，他汀类药物在降低LDL-C的同时也刺激前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)的产生，后者限制了LDL-C的降低效果，即他汀类药物剂量加倍疗效并不成倍增加，仅获得6%的增加。不仅如此，部分患者即使接受最大可耐受剂量的他汀类药物治疗仍存在相当大的血脂残余风险。孟德尔随机化研究证实，血脂残余风险的主要原因在于脂蛋白代谢异常和脂蛋白a [Lp(a)]水平升高[5]。新型降脂药物PCSK9单克隆抗体降低51%的LDL-C水平，同时残余风险降低15%[6-7]，然而这种方法需使用大量的抗体才能实现药效学效应，进而产生了安全问题，限制其广泛应用[8]。mRNA的药理靶向是一种新兴的降脂疗法。目前已发展出两大类——反义寡核苷酸(ASO)和小干扰RNA(siRNA)，在RNA产物(ASO或siRNA)中加入N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，促进了高效的肝脏特异性药物摄取，使用剂量明显降低，从而减少全身暴露和注射部位的局部反应。因此，全身、肝脏和局部副作用的发生率大大降低，极大地增加了药效和安全性[9]。如今，以RNA为基础的治疗方法正在大规模开发。

1 RNA靶向治疗

1.1 去唾液酸糖蛋白受体与GalNAc

Ashwell等[10]于1965年在研究铜蓝蛋白代谢的过程中，偶然发现去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的存在。ASGPR在肝细胞上大量表达，每个细胞上的受体超过500 000个[11]，GalNAc是半乳糖聚糖的氨基糖衍生物，ASGPR通过网格蛋白介导的内吞作用摄取和清除循环中一类特殊的糖蛋白，这类糖蛋白的末端糖残基为非还原性的半乳糖和GalNAc。研究表明，在与ASGPR的结合中，其亲和力大小取决于半乳糖残基数量、糖之间的几何间距和糖的类型(GalNAc>Gal)[12-13]。其中分子间距为20 Å的三触角GalNAc与ASGPR具有最高的亲和力。

1.2 RNA靶向治疗技术

从癌症到流行性病毒大暴发再到ASCVD，双链siRNA诱导的RNA干扰反应在治疗各种人类疾病中具有巨大的潜力。与大多数小分子药物相比，单链ASO和siRNA的体积要大得多，几十年来，细胞摄取和释放药物进入细胞质一直是RNA靶向药物临床应用的瓶颈。目前的给药途径通常是基于纳米颗粒的包封或配体的偶联，以促进特定细胞的摄取。但由于脂质纳米颗粒的促炎作用，临床使用这些药物时，通常需使用高剂量的皮质类固醇、组胺受体拮抗药和非甾体抗炎药进行预处理，以避免输液反应[14]。到目前为止，在所有的配体研究中，GalNAc成为在心血管医学领域最有希望的靶点。

1.3 GalNAc特异性结合ASO和siRNA

在内吞作用下，三触角GalNAc与ASGPR结合后进入肝细胞中。核内体成熟过程中的酸化阶段，GalNAc-siRNA偶联物从ASGPR上解离，ASGPR再循环到细胞表面。GalNAc在1 h内被核内体糖苷酶从siRNA上切割下来，4 h内连接臂降解[15]。绝大多数游离siRNA在核内体中被捕获，但仍有极少量(<1%)siRNA能通过未知机制穿过核内体脂质双层膜进入细胞质。siRNA的引导链在细胞质中与客链分离，随后组装RNA诱导沉默复合物(RISC)。RISC中的引导链与互补的靶mRNA结合，降解靶mRNA[14]，RISC再次循环，进一步降解被同一引导链识别的目标mRNA。与siRNA相比，ASO通常通过多种机制以1∶1的比例降解mRNA，其中之一是通过核糖核酸酶(RNase)H1降解互补mRNA(见图1)。两种药物作用途径都是阻止mRNA被翻译，同时肝细胞中siRNA和20-甲氧基硫代磷酸取代的ASO的作用强烈而持久，其消除半衰期为数周之久。

图1 GalNAc促进ASO和siRNA跨膜运输注：GalNAc结合的siRNA和ASO通过ASGPR被肝细胞特异性摄取。内吞摄取后，核内体的pH值下降，少量RNA靶向药物通过未知的机制被释放到细胞质中。进入细胞质后，药物与互补的mRNA相互作用。

2 针对ASCVD的RNA治疗靶点

ASO和siRNA通过与GalNAc结合，增强跨膜渗透，将药物靶向运送至特定组织，从而促进药物的传递。ASO通过GalNAc连接可将在肝细胞的效应提高至游离ASO的10倍[15]。不同于ASO，siRNA在细胞内处于失活状态。直到反式激活反应性RNA结合蛋白，随后RNA结合蛋白将siRNA装载至Argonaute蛋白2(Ago2)，在Ago2上，引导反义链与催化性Ago2特异性结合。Ago2提供与靶mRNA结合的初始引导链种子区域[16]，相比于自由ASO，反应需要的活化能大大降低[17]。

2.1 降低LDL-C的靶点：PCSK9

PCSK9是LDL-C代谢最重要的调节因子之一。它在肝细胞的内质网合成和修饰，并促进细胞膜低密度脂蛋白受体(LDLR)在溶酶体中降解。此外，PCSK9也抑制细胞内载脂蛋白(Apo)B的降解，ApoB是LDL和极低密度脂蛋白颗粒的组成部分[18]，在致动脉粥样硬化进程中有着重要作用。PCSK9功能缺失性突变可显著降低LDL-C浓度，有研究显示携带功能缺失性突变的个体LDL-C水平较基线降低28%，冠心病终生风险降低88%[19]。针对PCSK9，基于抗体的方法可将LDL-C水平降低45%～60%[20]，近来一种抑制PCSK9合成的RNA靶向治疗方法也被开发出来。

Inclisiran(ALN-PCSSC;ALN-60212)是一种GalNAc修饰的siRNA，不同于抗体的作用机制，Inclisiran靶向进入肝细胞，与PCSK9的mRNA前体特异性结合后对其进行降解，抑制PCSK9基因的表达[21]，同时降低细胞内和细胞外PCSK9蛋白水平。在两项Ⅲ期试验(ORION-10、ORION-11)中，针对杂合子型家族性高胆固醇血症及ASCVD患者，在第1天、第90天、第270天和第450天分别注射300 mg Inclisiran。在第510天时，Inclisiran治疗组较基线LDL-C水平分别降低52.3%(ORION-10)和49.9%(ORION-11)[22]，同时整体血脂水平也显著降低。如今心血管结果试验(ORION-4)正在进行中(NCT03705234)，中国也将参与[23]，预计于2024年完成。

2.2 降低ApoA的靶点：Lp(a)

Lp(a)是一种由肝脏合成的类似LDL的颗粒，由ApoB100分子与ApoA共价连接组成，具有促动脉粥样硬化，促血栓形成和促炎作用[24]。Lp(a)的血浆浓度在很大程度上是由遗传决定的[25]，既无法用生活方式干预，目前也少有降脂药物能有效降低Lp(a)水平。降脂治疗的基石在于他汀类药物，而他汀类药物上调LDLR降低LDL-C的同时可引起ApoA表达增加，使Lp(a)水平提高约20%[26]。孟德尔随机研究证实ApoA同工型大小和Lp(a)浓度是ASCVD的独立危险因素[27]，因此采用ASO抑制ApoA mRNA翻译，从而降低血浆Lp(a)水平，不失为一种可行的方法。第一代ASO是ISIS-APO(a)Rx，在TQJ230的Ⅰ期试验中显示，多次给药后，Lp(a)浓度呈剂量依赖性降低：39.6%(600 mg组)、59%(1 200 mg组)和77.8%(1 800 mg组)。AKCEA-APO(a)-LRx(也称为TQJ230)是ISIS-APO(a)Rx的修改版本，是一个通过GalNAc共价连接的ASO变体，其效力是ISIS-APO(a)Rx的30倍[28]。在Ⅱ期临床试验[29]中再次显示，AKCEA-APO(a)-LRx呈剂量及频率依赖性降低Lp(a)，在每周20 mg剂量下，血脂水平明显改善，Lp(a)降低80%，LDL-C降低20.5%，ApoB降低14.5%。目前，HORIZON Ⅲ期临床试验(NCT04023552)纳入7 680例ASCVD患者，计划周期4年，进一步明确降低Lp(a)对终点事件的影响。此外，siRNA分子AMG890也进入Ⅱ期临床试验(NCT04270760)，将共同探讨特异性降低Lp(a)是否能对ASCVD患者提供显著的临床获益。

2.3 降低甘油三酯的靶点：ApoCⅢ

ApoCⅢ主要由肝脏分泌，肠道分泌较少，由于其对ApoB脂蛋白分解代谢的抑制作用，被认为是甘油三酯(TG)分解代谢的重要负调控因子[30]。血清TG低水平为特征的ApoCⅢ功能缺失突变携带者的ASCVD风险降低40%[31]，在针对年龄和性别调整后的模型中，血浆中ApoCⅢ每降低1 mg/dL，心血管疾病风险降低4%[32]。

第一种专门针对ApoCⅢ mRNA的药物是Volanesorsen，被批准用于家族性乳糜微粒血症综合征。Volanesorsen是一种20-甲氧基修饰的硫代磷酸ASO，而三触角GalNAc复合物结合的AKCEA-APOCⅢ-LRx(ISIS678354)与Volanesorsen具有相同的核苷酸序列。在健康人志愿者试验中，AKCEA-APOCⅢ-LRx组患者ApoCⅢ水平降幅为92%，TG水平降幅为77%。Ⅱ期临床试验中，TG升高的心血管疾病患者同样显示出广泛的血脂改善，包括显著降低TG、总胆固醇、非高密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇，增加高密度脂蛋白胆固醇，且安全性和安慰剂无明显差异[9]。目前Ⅲ期心血管试验还处于进一步筹备中。

2.4 降低TG的靶点：血管生成素样蛋白3

血管生成素样蛋白(ANGPTL)为脂蛋白代谢的重要调节因子，因此已成为调节脂质水平和心血管疾病风险的新靶点。ANGPTL3属于angptl蛋白家族，由n端盘绕卷曲结构域和纤维蛋白原样c端结构域组成[33]。ANGPTL3在肝脏合成，通过抑制脂蛋白脂酶从而介导处于脂肪组织和肌肉的毛细血管中TG的水解。除抑制脂蛋白酶，ANGPTL3还可抑制内皮脂肪酶，从而影响血清高密度脂蛋白胆固醇水平[34]。DiscovEHR研究显示，ANGPTL3功能缺失变异的杂合子患者血浆ANGPTL3水平比非携带者低约50%，其冠状动脉疾病的风险降低34%～39%[35]。19项研究(共计21 980例心血管疾病患者和158 200例对照者)的荟萃分析[36]显示，携带ANGPTL3功能缺失性突变的人群比对照组的心血管疾病风险低34%。最低浓度ANGPTL3组比最高浓度组心肌梗死风险降低29%。目前研发中的药物包括ASO(IONIS-ANGPTL3-LRx)及针对ANGPTL3的人单克隆抗体(Evinacumab)，ASO和Evinacumab均可显著降低血清ANGPTL3和所有主要脂蛋白的血浆浓度。目前抑制ANGPTL3的Ⅱ期临床试验正在进行中，其中Evinacumab降低TG幅度为76%，降低LDL-C为23%[35]。而接受IONIS-ANGPTL3-LRx治疗的受试者表现为主要脂质成分水平的降低，其中TG(33.2%～63.1%)、LDL-C(1.3%～32.9%)、极低密度脂蛋白胆固醇(27.9%～60%)、非高密度脂蛋白胆固醇(10%～36.6%)、ApoB(3.4%～25.7%)和ApoCⅢ(18.9%～58.8%)[37]。Ⅱ期临床研究目前正在进行中(NCT03371355)，同时针对ANGPTL3 mRNA的siRNA目前正在健康志愿者和血脂异常患者中进行Ⅰ期试验(NCT03747224)。未来的Ⅱ和Ⅲ期临床试验将获得更多数据，以确定它们的长期疗效、安全性和耐受性。

3 未来展望

LDL-C管理仍是ASCVD降脂治疗的基础，血脂管理指南更新，显示LDL-C靶目标值不断降低，联合非他汀类药物的降脂疗法已成为ASCVD的治疗趋势。相对于抗体类药物而言，RNA靶向药物的主要优势在于精准靶向编码区域的蛋白质，这为降脂治疗提供了新的解决思路。目前，GalNAc联合RNA靶向治疗[如Apo(a)-ASO和PCSK9-siRNA]的心血管预后试验正在进行中。毫无疑问，由于RNA疗法的高度靶向特异性，这些试验的结果将极大地促进对脂蛋白颗粒在ASCVD中病理生理作用的理解，最大程度降低ASCVD的残余风险。在不久的将来RNA疗法极有可能成为一种新的、安全、有效的ASCVD治疗选择。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。