蒋威华, 伊丽娜, 张晨光, 雪来提·派祖拉, 许文婷, 欧江华

(新疆医科大学附属肿瘤医院 乳腺外科二病区, 新疆 乌鲁木齐, 830011)

乳腺癌是女性最常见恶性疾病，手术治疗、放化疗、内分泌治疗、靶向治疗和免疫治疗疗效显著，但仍有部分患者出现原发性耐药和复发转移[1]。三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，目前治疗手段较少，与非三阴性乳腺癌患者比较，预后极差[2-3], 至今仍不能采用单因素或多因素模型来完全解释其发生及发展机制，因此生物学预后因子对TNBC的预后判断和临床治疗具有重要作用。间质-上皮细胞转化因子(c-Met)属于酪氨酸激酶受体家族(RTKS)成员，与其配体肝细胞生长因子(HGF)相结合后，可激活下游信号传导通路，参与肿瘤细胞生长、增殖、转移等重要生物学活动[4-5]。研究[6]显示, MET阳性TNBC患者总生存期较短，其死亡风险是阴性患者的1.779倍，而针对c-Met阳性的TNBC患者靶向治疗时应联合MET和表皮生长因子受体(EGFR)才能获益更大。研究[7]发现，脂肪酸合成酶(FASN)在乳腺癌患者中表达水平越高，肿瘤恶性程度越高，肿瘤复发、转移及患者死亡的风险越高[8]。TNBC患者中，联合抑制FASN和EGFR的活性可起到协同增强抗肿瘤作用，因此封锁FASN和EGFR靶点在TNBC临床治疗模式中，是一个新的治疗方向[9]。本研究检测c-Met及FANS在TNBC中的表达，探讨c-Met及FANS与TNBC患者临床病理特征的关系及其对预后的影响，对与EGFR有协同抗肿瘤作用两项指标进行联合检测，以期为此类患者进行更精确的预后判断并提供可能的治疗方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013—2015年在新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科行手术切除且术后常规病理检查确诊为TNBC的218例女性患者的临床资料，年龄27～71岁，中位年龄46岁，分别选取患者癌组织及癌旁组织。纳入标准: ① 首次治疗并可实施手术的患者; ② 雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER2)表达均为阴性的浸润性乳腺癌患者; ③ 有完整病理资料及随访资料者。排除标准: ① ER、PR、HER2表达均为阴性的原位癌患者; ② 非三阴性浸润性乳腺癌患者。

1.2 实验方法

采用免疫组织化学染色法(SP)检测c-Met蛋白及FASN蛋白表达水平，免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋, 4 μm厚切片，常规脱蜡，经梯度酒精水化，磷酸盐缓冲液(PBS)(pH值=7.4)浸洗5 min, 反复浸洗3次，然后高温、高压抗原修复1 min, 蒸馏水冲洗3 min, 反复冲洗2次，再用PBS冲洗3次，每次2 min, 切片置于湿盒中，每张切片滴加过氧化氢甲醇溶液50 mL, 室温下(约20 ℃)孵育10 min，封闭内源性过氧化酶活性，采用PBS冲洗3次，每次5 min; 滴加第一抗体, c-Met稀释度为1∶200, FASN为1∶100, 孵育4 ℃过夜, PBS冲洗5 min, 反复3次; 滴加检测试剂，室温下孵育30 min, 最后再用PBS冲洗3次，每次5 min; 滴加显色试剂，苏木素复染，脱水，分色，以PBS代替一抗做阴性对照，以选取的乳腺癌组织切片做阳性对照。

1.3 c-Met及FANS表达结果判读标准

c-Met蛋白主要存在于胞膜上，由2名病理科医师采取双盲观测，将阳性细胞占比和细胞染色强度作为综合判断标准。阳性细胞染色占比计分标准: 阴性为0分，阳性细胞占比<25%计1分, 25%～50%计2分, >50%～75%计3分, >75%计4分; 染色强度计分标准: 无染色为阴性计0分，淡黄色为弱阳性计1分，深黄色为中阳性计2分，棕褐色为强阳性计3分。2项指标相加得分≤4分为阴性，>4分为阳性。

FANS阳性表达为胞浆染色棕色，将标本切片的染色强度和阳性细胞染色占比分别记分后相加，所得分数即为最后评分。染色强度评分判定标准: 染色不显色为0分，染色呈浅棕色为1分，染色呈棕色为2分，染色呈深棕色为3分; 阳性细胞染色占比计分标准: 阳性细胞染色占比≤1%为0分, >1%～10% 为1分, >10%～50% 为2分, >50%～80%为3分, >80%为4分。总分<4分为阴性，总分≥4分为阳性。

1.4 随访

本研究随访时间自术后开始计算，随访截至2020年5月，主要生存期评估指标为5年无瘤生存时间(DFS)。DFS指从术后第1天至肿瘤局部复发、区域性复发或远处转移的时间; 局部复发指乳腺癌术后同侧乳腺或胸壁再次出现同一性质肿瘤; 区域性复发指乳腺癌区域淋巴结(腋窝、锁骨上/下及内乳淋巴结)清扫术后再次出现肿瘤; 远处转移指乳腺癌术后，肿瘤细胞通过任一转移途径转移到远离原发部位的组织和器官，并生长出同一性质肿瘤。

1.5 统计学分析

数据均采用SPSS 17.0软件进行统计分析处理，计数资料采用χ2检验, Kaplan-Meier法进行生存分析，并使用Log-rank检验比较组间生存曲线差异，本研究所有检验水准均取α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 c-Met及FASN在TNBC癌组织中的表达情况及其与临床病理特征的关系

218例TNBC组织中, c-Met蛋白阳性表达130例，阳性率59.6%; 癌旁组织中, c-Met蛋白阳性表达65例，阳性率29.8%。c-Met在癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。FASN阳性表达142例(65.1%), 癌旁组织中阳性表达30例(13.8%), TNBC癌组织中FASN阳性表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 c-Met及FASN在TNBC癌组织及癌旁组织中

卡方检验结果显示，腋窝淋巴结转移患者的 c-Met及FASN阳性表达率高于腋窝淋巴结未转移者，临床分期Ⅲ期患者阳性表达率高于Ⅰ期患者，差异均有统计学意义(P<0.05), 但与肿瘤直径无关(P>0.05)。合并糖尿病患者中, FASN阳性表达率高于无糖尿病患者，且体质量指数越高, FASN的阳性表达率也越高，差异有统计学意义(P<0.05), 而c-Met的阳性表达与糖尿病及体质量指数无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 c-Met及FASN在TNBC组织的表达及与临床病理特征的关系[n(%)]

2.2 c-Met及FASN阳性表达的TNBC患者生存情况分析

218例患者中, 54例(24.8%)出现复发转移，复发转移患者及未复发转移患者的c-Met及FASN表达情况见表3。

表3 TNBC患者复发远处转移情况[n(%)]

统计结果显示, c-Met及FASN阳性表达患者的5年无瘤生存率均低于阴性表达患者(P<0.05)。130例c-Met阳性和88例阴性患者5年无瘤生存率分别为70.0%和82.9%。c-Met阳性和阴性表达患者的生存率比较，差异有统计学意义(P<0.05), 见图1。

图1 c-Met表达与TNBC患者无瘤生存率关系

142例FASN表达阳性患者5年复发转移42例, 5年无瘤生存率为70.4%; 76例FASN阴性表达患者中复发转移12例，5年无瘤生存率为84.2%，差异有统计学意义(P<0.05), 见图2。

图2 FASN表达与TNBC患者无瘤生存率的关系

3 讨 论

c-Met是原癌基因c-Met编码的蛋白，编码该受体的基因位于7号染色体7q21-q31上，属于酪氨酸激酶受体家族(RTKS)成员，主要存在于上皮细胞的胞膜上[4], 可促进肿瘤组织新血管形成、淋巴管生成、肿瘤细胞增殖分化、抵抗肿瘤细胞凋亡等，影响恶性肿瘤浸润和晚期远处转移[10]。研究[11-13]发现, c-Met在结肠癌、胰腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤浸润、复发和晚期远处转移中起着至关重要作用。

本研究结果显示, 218例TNBC癌组织中c-Met蛋白阳性表达130例，阳性表达率为59.6%, TNBC癌组织中c-Met蛋白阳性表达率高于癌旁组织，与ZAGOURI F等[14]研究结果相近，且c-Met阳性率随着TNBC组织学分级与TNM分期的增加而增高，腋窝淋巴结转移患者的c-Met阳性率高于腋窝淋巴结未转移患者，表明c-Met高表达与癌细胞的侵袭性及增殖活力有关，但具体机制还需进一步研究。生存分析显示, c-Met阳性的TNBC患者预后较差。c-Met蛋白表达阳性在多项研究[15]中被证明是乳腺癌预后不良的因素。一项荟萃分析[16]结果显示, c-Met蛋白高表达在各亚型乳腺癌患者中均有较差的总生存期(OS)及DFS, 可作为判断乳腺癌患者预后的重要指标。研究[17]认为, c-Met的表达与TNBC关系密切, c-Met阳性的TNBC患者有较低的无瘤生存率和OS, 推测c-Met蛋白高表达在TNBC细胞的增殖、进展及转移中起着重要作用，但如果要将c-Met作为肿瘤治疗靶点，还应考虑TNBC中EGFR的表达状态。研究[18]表明，TNBC患者联合表达Met和EGFR的患者无病生存情况显著差于只表达EGFR的患者，因此TNBC的靶向治疗应联合Met和EGFR才能使其治疗获益。

FASN是脂肪酸合成的关键酶，位于细胞胞浆内，是一种二聚体蛋白，具有多种酶活性[19]。FASN在多种恶性肿瘤组织中呈高表达状态，而在正常组织中不表达或低表达。研究[20]显示, FASN表达水平与乳腺肿瘤恶性程度关系密切，且对预后有一定的判断作用。

本研究FASN在TNBC癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，同时, FASN的表达状态与患者腋窝淋巴结转移、组织学分级、2型糖尿病及肥胖有关(P<0.05)，这与相关研究[21]结果相符。FONTANELLA C等[22]研究结果显示，与非肥胖患者相比，肥胖TNBC患者中，体质量指数越高，生存期越短，因此肥胖是影响患者预后的一项危险因素。肥胖患者就诊时肿瘤直径较大，淋巴结分期和临床分期较高，肿瘤侵袭性更强，最终可导致较差的预后[23]。本研究随访结果显示，FASN在TNBC组织中阳性表达患者预后较阴性表达患者预后差。研究发现，高表达FASN可导致耐药的发生，降低FASN表达可增强化疗药物的敏感性[24]，TNBC组织中FASN高表达致化疗不敏感可能是导致此类患者预后较差的一个因素，建议TNBC且肥胖患者应适当控制体质量，糖尿病患者有效控制血糖，降糖的同时降低FASN的活性，以获取更好的疗效。研究[9]发现，针对FASN靶点的治疗，联合抑制EGFR和FASN活性不但具有较强的抗肿瘤作用，而且对化疗药物有耐药性的TNBC也有效，因此同时封锁FASN和EGFR靶点在TNBC是一个新的治疗方向。

TNBC的预后受多种生物学因素影响，包括多种蛋白相互作用、基质环境、基因拷贝数等。本研究检测c-Met及FANS在TNBC中的表达结果发现，c-Met及FASN在TNBC癌组织中的阳性率均高于癌旁组织, c-Met及FASN阳性表达患者的5年无瘤生存率均低于阴性表达患者，说明c-Met及FASN的阳性表达影响TNBC患者的预后。c-Met和FASN都与EGFR有协同抗肿瘤作用，针对TNBC的这两个靶点治疗，都需要联合抑制EGFR。本研究首次探讨2项指标与TNBC治疗及预后相关指标的关联性，为阐明TNBC细胞增殖、进展、转移的机制及靶向药物的研制提供一定依据，同时也可作为判断TNBC患者预后的检测指标。