桂照华, 吴 景, 李晓洁, 闫 红

(1. 中国科学技术大学第一附属医院 临床病理中心, 安徽 合肥, 230001;2. 中国科学技术大学附属第一医院西区/安徽省肿瘤医院 病理科, 安徽 合肥, 230001)

乳腺癌是发病率和致死率最高的恶性肿瘤，严重危害女性的生命健康[1-2]。St. Gallen乳腺癌共识[3]根据乳腺癌分子的表达状态对乳腺癌进行了分组，每个分子亚型对内科治疗、手术治疗、化疗的敏感性以及预后均存在一定的差异。胰岛素样生长因子-1( IGF-1)属于胰岛素样生长因子家族一员，可增强有丝分裂，调节体内激素的合成、分泌，并对细胞的趋化、免疫和迁移具有一定的影响。研究[4]表明, IGF-1在乳腺癌中也存在较高的表达。骨形态发生蛋白9(BMP-9)属于骨形态发生蛋白的一种，可调控人体细胞的生长和分化。研究[5]证实，BMP-9在乳腺癌的细胞增殖分化和转移中发挥重要作用，但其与乳腺癌患者临床体征的关系仍未明确。本研究对98例乳腺癌患者的临床资料进行分析，探讨BMP-9、IGF-1在不同分子亚型乳腺癌中的表达及其与临床特征的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年3月—2020年3月收治的98例乳腺癌患者为研究对象。纳入标准: ① 患者符合《乳腺癌临床诊断治疗实用手册》[6]中乳腺癌诊断标准; ② 患者年龄>18岁; ③ 患者精神正常; ④ 患者无大面积癌细胞转移。排除标准: ① 患者存在脑梗死或者心肌梗死等重大疾病; ② 患者存在肺、肝、肾等重要器官障碍; ③ 患者存在免疫功能缺陷性疾病; ④ 患者资料不全; ⑤患者中途死亡或退出。

根据不同乳腺癌分子亚型将98例乳腺癌患者进行分组: ER和PR阳性、HER-2阴性、KI-67低表达为Luminal A型组(n=23); ER和PR阳性、HER-2阴性、KI-67高表达或者ER和PR阳性、HER-2阴性、KI-67任何水平为Luminal B型组(n=26); ER和PR阴性、HER-2阳性为HER-2过表达型组(n=24); ER阴性、PR阴性、HER-2阴性为Basal-like型组(n=25)[7]。Luminal A型组患者年龄43～77岁，平均(56.96±10.00)岁; Luminal B型组患者年龄29～79岁，平均(47.81±13.37)岁; HER-2过表达型组患者年龄30～80岁，平均(51.00±11.28)岁; Basal-like型组2患者年龄33～73岁，平均(48.92±10.30)岁。4组患者年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究所有患者及家属知情且签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 方法

BMP-9检测方式: 采用石蜡包埋组织切片提取乳腺癌组织总RNA, 石蜡组织切片总RNA提取试剂盒(RNAprep Pure FFPE Kit)购自北京天根公司。将乳腺癌组织取样后，迅速浸入4%～10%的甲醛中固定14～24 h, 彻底脱水后用石蜡包埋并切取5～10 μm厚度的石蜡切片8张，采用二甲苯脱蜡，并通过乙醇漂洗，接着通过蛋白酶K(Proteinase K)和DNA裂解液分别消化组蛋白和裂解DNA, 防止DNA和蛋白污染。最后通过吸附柱收集RNA后，利用NanoDrop微量分光光度计定量分析RNA的浓度和纯度。严格按照逆转录试剂盒说明书要求合成cDNA, 采用北京天根公司的Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒，严格按照说明书，以20 μL体系进行加样, 2.5×Real Master Mix/20×SYBR solution 9 μL, 上游引物为1 μL, 下游引物为1 μL, cDNA为1 μL, 双蒸水(ddH2O) 8 μL。反应条件为90 ℃持续预变性, 10 min; 按照95 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s进行40个连续循环反应。使用Primer 5.0软件设计引物, BMP9上游引物序列为5′-GTCTTACAGGAGCATCAGCACAG-3′, 下游引物序列为5′-GGAGTCACAACCCACAGATTG-3′; GAPDH上游引物序列为5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′, 下游引物序列为5′-GTAGAGGCAGGGATGATAGGCT-3′。所有标本均置于100 mL/L的中性甲醛内固定; 将石蜡包埋组织以2 μm厚度进行切片; 常规脱蜡，并采用抗原进行修复后封闭，采用SP法染色，使用北京中杉金桥公司的DAB显色试剂盒进行显色，采用苏木素再次染色，脱水，透明，封片后采用显微镜观察。BMP-9阳性标准为棕黄色颗粒，参考HODGSON J等[8]研究采用的方法。每位患者连续进行3次检测，并求平均值。

IGF-1检测方式: 将乳腺癌组织取样后，迅速浸入4%～10%的甲醛中固定14～24 h, 彻底脱水后用石蜡包埋并切取5～10 μm厚度的石蜡切片8张，采用二甲苯脱蜡及乙醇漂洗，接着通过蛋白酶K (Proteinase K)和DNA裂解液分别消化组蛋白和裂解DNA, 防止DNA和蛋白污染。最后通过吸附柱收集RNA后，利用NanoDrop微量分光光度计定量分析RNA的浓度和纯度，采用反转录酶将RNA反转录为cDNA。IGF-1基因上游引物序列为TGGAGTTGGTAGATT GCTGTTG, 下游引物序列为TATGAAGGGAGGTGGTGGGTAT, 产物大小为233 bp; β-actin(内参基因)上游引物序列为AGCGGGAAA TCGTGCGTGAC; 下游引物序列为ACATCTGCTGCAGGAAGG TGGAC, 产物大小为453 bp。将扩增产物进行2%琼脂凝胶电泳，采用EB染色后，在紫外荧光数字成像仪下进行拍摄，并以吸光度定量分析，以β-actin为内参或对照, IGF-1扩充产物条带吸光度与β-actin条带吸光度的比值作为IGF-1 mRNA的相对表达量。所有标本均放于100 mL/L的中性甲醛内固定; 将石蜡包埋组织以2 μm厚度进行切片; 常规脱蜡，并采用抗原进行修复后封闭，采用SP法染色，采用北京中杉金桥公司的DAB显色试剂盒进行显色，采用苏木素再次染色，脱水，透明，封片后采用显微镜观察。IGF-1阳性标准为细胞质或细胞膜为棕黄色颗粒，采用Volm双色法进行评分[9]。显微镜视野下染色细胞<10%为(+), 10%～50%为(), >50%为()。每例患者连续进行3次检测，并求平均值。

1.3 观察指标

对4组患者骨BMP-9、IGF-1表达水平进行比较; 对患者肿瘤组织内BMP-9、IGF-1表达水平与患者临床体征的关系进行分析。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 4组患者BMP-9表达水平比较

BMP-9在98例乳腺癌中阴性表达为36例，阳性表达为62例; HER-2过表达组BMP-9 mRNA水平和BMP-9蛋白阳性率与Basal-like组比较，差异无有统计学意义(P>0.05); HER-2过表达组和Basal-like组BMP-9 mRNA水平和BMP-9蛋白阳性率均低于Luminal型A组及Luminal B型组，且Luminal B型组低于Luminal A型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组患者BMP-9表达水平比较

2.2 4组患者IGF-1表达水平比较

IGF-1在98例乳腺癌中阴性表达为36例，阳性表达为62例; HER-2过表达型组IGF-1mRNA水平和IGF-1蛋白阳性率与Basal-like型组比较，差异无统计学意义(P>0.05); HER-2过表达型组和Basal-like 型组IGF-1 mRNA水平和IGF-1蛋白阳性率均高于Luminal A型组及Luminal B型组，且Luminal B型组高于Luminal A型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 4组患者IGF-1表达水平比较

2.3 BMP-9表达与患者临床特征关系

乳腺癌患者BMP-9 mRNA和BMP-9蛋白表达与年龄无关，差异无统计学意义(P>0.05); 乳腺癌患者BMP-9 mRNA和BMP-9蛋白表达与肿瘤直径、淋巴结转移数目、TNM分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 BMP-9表达与患者临床特征关系

2.4 IGF-1表达与患者临床特征的关系

乳腺癌患者IGF-1 mRNA和IGF-1蛋白表达与年龄无关，差异无统计学意义(P>0.05); 乳腺癌患者BIGF-1 mRNA和IGF-1蛋白表达与肿瘤直径、淋巴结转移数目、TNM分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 IGF-1表达与患者临床特征关系

2.5 BMP-9、IGF-1表达与患者临床特征相关性分析

BMP-9 mRNA和BMP-9蛋白表达与患者肿瘤直径、淋巴结转移数目和TNM分期呈负相关; IGF-1 mRNA和IGF-1蛋白表达与患者肿瘤直径、淋巴结转移数目和TNM分期呈正相关。见表5。

表5 BMP-9、IGF-1表达与患者临床特征相关性分析

3 讨 论

乳腺癌是指出现在乳腺上皮以及导管上皮的恶性肿瘤，其病因尚未明确，可能与家族史和乳腺癌相关基因、生殖激素、性激素有关。乳腺癌的发病率呈逐年升高趋势，严重威胁女性生命健康。由于乳腺癌的早期症状并不明显，仅出现乳房肿块、乳房皮肤异常等症状，所以通常在确诊时已为中晚期，癌细胞已出现远处扩散，同侧腋窝淋巴结肿大且出现全身病变，预后极差，故乳腺癌的早期诊断极其重要[10-12]。随着医学技术的发展及对乳腺癌研究的加深，已有关于诊断乳腺癌基因对乳腺癌生物学行为和预后的相关研究[13-15]。为进一步了解不同亚型乳腺癌组织中的生化变化，本研究对比了不同类型及预后患者的BMP-9及IGF-1表达水平。

BMP-9又被称为生长分化因子2, 参与血管、骨的生成和再生，且能够维持胚胎神经元的类胆碱分化和调节葡萄糖、脂肪酸的代谢等[16]。IGF-1是一种多功能生长因子，能够帮助细胞增殖分化和凋亡，参与多种肿瘤的发展、转移和侵袭[17]。相关文献将乳腺癌根据临床分子不同分为了4种亚型，包括Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型、Basal-like型。本研究表明, HER-2过表达型组和Basal-like型组BMP-9 mRNA水平和BMP-9蛋白阳性率显著低于Luminal A型组和Luminal B型组，且Luminal B型组显著低于Luminal A型组; IGF-1mRNA水平和IGF-1蛋白阳性率显著高于Luminal A型组和Luminal B型组，且Luminal B型组显著高于Luminal A型组(P<0.05)。既往研究[18-19]认为, HER-2过表达型和Basal-like型的预后最差，也容易出现转移，Luminal A型预后最佳，提示BMP-9和IGF-1在乳腺癌的发展和预后发挥重要作用。本研究认为，乳腺癌患者BMP-9 mRNA和BMP-9蛋白表达与肿瘤直径、淋巴结转移数目、TNM分期显著相关(P<0.05)，且与患者肿瘤直径、淋巴结转移数目和TNM分期呈负相关。BMP-9水平的降低也是导致乳腺癌患者预后较差的原因之一。研究认为, IGF-1在体内含量越高，出现乳腺癌的风险也越高。薛晶等[20]研究认为，乳腺癌组织内的IGF-1高表达与肿瘤大小、淋巴结转移和组织学分级有关，与本研究结果相符，即乳腺癌患者IGF-1 mRNA和IGF-1蛋白表达与肿瘤直径、淋巴结转移数目、TNM分期呈正相关。分析原因可能为IGF-1在乳腺癌发展的早期就已出现，同时由于乳腺癌生长、恶性程度以及转移，导致体内IGF-1异常表达。此外，本研究发现BMP-9与IGF-1的表达水平具有极强的相关性，且两者均属于Smad通路，提示Smad通路的调节异常可能是乳腺癌发生、发展的相关因素[21]。

综上所述, BMP-9、IGF-1的表达与乳腺癌患者临床分子亚型有关, BMP-9在Basal-like型和HER-2过表达型中表达较低, IGF-1在Basal-like型和HER-2过表达型中表达水平较高。BMP-9的表达与患者肿瘤直径、淋巴结转移数目和TNM分期呈负相关; IGF-1的表达与上述指标呈正相关。在临床工作中，应将BMP-9、IGF-1纳入检测，以预测患者临床预后，并对IGF-1高表达、BMP-9低表达的患者进行积极干预，以改善临床疗效。