陈观平， 汪一帆， 应栩华

（浙江省立同德医院中西医结合肿瘤研究所，浙江杭州 310012）

肺癌的高转移性是造成患者高病死率的主要因素，一旦发生远处转移，严重影响患者的临床疗效及生存时间[1]。肿瘤转移是一个非常复杂的过程[2]，深入研究肺癌的临床治疗及其远处转移的防治，使之更好地指导临床应用，对降低肺癌病死率，改善临床预后有重要意义。扶肺煎为我院多年使用的抗肺癌临床具有效验方，前期的研究表明，扶肺煎不仅能改善肺癌患者免疫功能、减轻临床症状，还可促进抑癌基因、肿瘤转移抑制基因的表达[3]；扶肺煎可降低C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤Bcl-2 基因的表达，提高Bax 基因的表达，起到控制细胞生长及分化、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用[4]。而Bcl-2、Bax为信号转导与转录激活因子（STAT3）下游靶基因[5]。为进一步探讨扶肺煎抑制肺癌细胞增殖、迁移的作用机制，本研究通过体内外实验观察扶肺煎对肺癌细胞STAT3信号传导通路的影响，以期为扶肺煎临床治疗肺癌提供理论依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及培养 人肺癌细胞株A549、SPC-A1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。人肺癌细胞株A549、SPC-A1 培养于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱，以含体积分数10%胎牛血清的1640 培养基培养，每2 d 传代1 次，维持细胞密度为80%左右。

1.2 实验动物 雄性健康SPF级3 ～4周龄C57BL/6小鼠，体质量（18±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2015-0001。雄性健康SPF级6 ～7周龄SD大鼠，体质量（180±10）g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物质量合格证号：Abzz0619067637。所有动物均饲养于浙江省中医药研究院SPF级实验动物中心，饲养温度为20～25 ℃，湿度为40%～70%。

1.3 药物及制备 扶肺煎方药组成：生晒参10 g，北沙参12 g，炙黄芪30 g，枸杞子12 g，天葵子12 g，猫爪草20 g，紫花地丁20 g，蜈蚣3 条。上述中药材均购自杭州华东中药饮片有限公司，经浙江中医药研究院浦锦宝教授鉴定为道地药材。于浙江省立同德医院制剂室煎制，方法：称取复方中各药材后，加入10 倍药量的水，煎煮2 次（分别为2、1.5 h），收集、合并2次滤液，减压浓缩至适当体积，最终成2 g/mL的药液，于4 ℃保存备用。

1.4 试剂与仪器 RPMI-1640 培养基（美国Hyclone 公司）；胎牛血清（美国Gibco 公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8）、放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗人细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）单克隆抗体（美国CST 公司）；多聚体抗兔免疫球蛋白G（IgG）-辣根过氧化物酶（HRP）（武汉博士德公司，货号：SV0002）。蛋白电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；CO2培养箱（美国Thermo Fisher 公司）；PCR仪（美国ABI 公司）；倒置显微镜（日本Olympus 公司）；多功能酶标仪（美国MD公司）。

1.5 体外研究

1.5.1 含药血清的制备 按照中药血清药理学及前期研究基础[6-7]，将大鼠随机分为空白对照组（15 只）、扶肺煎高剂量组（5只）、扶肺煎低剂量组（5 只）。扶肺煎高剂量组按生药30 g·kg-1·d-1灌胃、扶肺煎低剂量组按生药15 g·kg-1·d-1灌胃，空白对照组灌胃等体积生理盐水，连续灌胃7 d，末次灌胃1 h后无菌条件下取血并分离血清过滤除菌。

1.5.2 细胞分组 分为5 组。空白对照组：10%空白对照血清+RPMI-1640培养基；扶肺煎低剂量组：10%低剂量组含药血清+RPMI-1640 培养基；扶肺煎高剂量组：10%高剂量组含药血清+RPMI-1640培养基；AG490组（阳性对照1）：10%空白对照血清+1640 培养基+10 μmol/L AG490；顺铂组（阳性对照2）：10%空白对照血清+1640 培养基+1 μmol/L 顺铂。

1.5.3 CCK8 法测定细胞增殖情况 取对数生长期的A549、SPC-A1细胞，接种于96孔板，5×103个/孔，每孔100 μL，培养箱中培养24 h 后弃上清。按“1.5.2”项方法处理，每组设4 个复孔，24、48、72 h 后终止培养。按CCK-8 试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪于450 nm 波长处检测各孔光密度（OD）值，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（%）= [（OD空白血清- OD含药血清）/（OD空白血清-OD空白）]×100%。

1.5.4 细胞划痕实验观察细胞迁移能力 取处于对数生长期状态良好的A549、SPC-A1细胞，接种于6孔板，待细胞长至80%左右，按“1.5.2”项方法处理。24 h 后，在每孔板中间用1 mL 枪头划痕，使各孔的细胞划痕宽度一致，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗去除细胞碎片。每孔换成含相应血清及药物的培养基2 mL，继续培养24 h，观察细胞迁移情况，并拍照记录。

1.5.5 Transwell 侵袭实验观察细胞侵袭能力 将对数生长期状态的A549、SPC-A1细胞调整密度为5 × 105个/mL，种 于6 孔 板，每 孔2 mL，按“1.5.2”项方法处理。24 h 后消化收集细胞，加入仅含RPMI-1640 的培养基重悬细胞，各组细胞均调整密度为1×106个/mL，分别取100 μL上述细胞悬液加入含Matrigel基质胶的Transwell 24孔板小室上室。下室加入600 μL 含10%胎牛血清培养液，培养箱培养24 h。弃去Transwell 小室中培养液，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，PBS洗涤，40 g/L多聚甲醛固定，结晶紫染色后拍照并统计穿过小孔的细胞。

1.5.6 蛋白免疫印迹法观察细胞Cyclin D1、CDK4、STAT3、p-STAT3蛋白的表达 按“1.5.2”项方法处理A549、SPC-A1细胞，48 h后裂解细胞并提取蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白，将蛋白转至PVDF 膜，经脱脂奶粉封闭，一抗Cyclin D1（1∶1 000 稀释）4 ℃孵育过夜，二抗IgGHRP（1∶5 000 稀释）孵育1 h，电化学发光（ECL）显色，成像，最后应用ImageJ 软件分析电泳条带的灰度值，以GAPDH 为内参计算各组目的蛋白含量。CDK4（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）、p-STAT3（1∶1 000）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（1∶1 000）等抗体的检测方法同上。

1.6 体内研究

1.6.1 造模、分组与干预方法 取对数生长期的Lewis 肺癌细胞，消化、离心后，调细胞混悬液浓度为1.0×107个/mL。于每只小鼠皮下接种细胞混悬液0.2 mL，建立Lewis 肺癌小鼠模型。24 h 后，随机分为4组，即模型组、扶肺煎低剂量组、扶肺煎高剂量组、顺铂组，每组12 只，分笼饲养。根据成人的临床用药剂量换算成相应小鼠用药剂量，其中，高剂量组相当于成人等效剂量的20 倍给药，低剂量组相当于成人等效剂量的10 倍给药。扶肺煎低、高剂量组，分别给予扶肺煎30、60 g·kg-1灌胃，每日1 次；顺铂组，给予顺铂2 mg/kg 腹腔注射，隔日1 次；模型对照组，给予0.5 mL生理盐水灌胃。连续14 d。

1.6.2 肿瘤转移情况与抑瘤率 末次给药后24 h颈椎脱臼法处死小鼠，取肺，肉眼观察肺转移灶，计算肺部转移结节个数，计算肺转移抑制率，肺转移抑制率（%）=（模型组平均转移结节个数-治疗组平均转移结节个数）/模型组平均转移结节个数× 100%。同时剥瘤并称质量，计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（对照组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量×100%。

1.6.3 免疫组织化学法检测移植瘤组织Cyclin D1、CDK4、p-STAT3 表达 将剥离的移植瘤固定12 h后，常规石蜡包埋切片。清除内源性过氧化酶后热修复抗原。滴加单抗p-STAT3（1∶200稀释）37 ℃孵育，DAB 显色，苏木精复染后镜检。阳性表达胞浆呈棕黄色颗粒状染色，每张片子随机抽取5个高倍镜视野（×200）采集图像，用Image Pro Plus 6.0软件分析测定每个视野积分光密度（IOD）。Cyclin D1（1∶250）、CDK4（1∶800）检测方法同上。

1.7 统计方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素分析，两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扶肺煎含药血清对A549、SPC-A1 细胞增殖的影响 表1 结果显示：干预A549 细胞48 h 后，扶肺煎低、高剂量组，AG490组，顺铂组的OD值较空白对照组降低（P ＜0.05 或P ＜0.01）；干预A549 细胞72 h 后，扶肺煎高剂量组、AG490 组、顺铂组的OD 值较空白对照组降低（P ＜0.05 或P ＜0.01）。表2 结果显示：干预SPC-A1 细胞48 h 后，扶肺煎高剂量组、AG490组的OD值较空白对照组降低（P ＜0.05）；干预SPC-A1细胞72 h后，AG490组、顺铂组的OD值较空白对照组降低（P ＜0.05或P ＜0.01）。表明扶肺煎可抑制A549、SPC-A1细胞的增殖，抑制A549 细胞的效果优于SPC-A1 细胞，且随扶肺煎含药血清处理时间的延长，干预作用逐渐减弱，48 h作用效果较好。

表1 扶肺煎含药血清对A549细胞增殖的影响Table 1 Effect of Fufei Jian-containing serum on proliferation of A549 cells （±s）

表1 扶肺煎含药血清对A549细胞增殖的影响Table 1 Effect of Fufei Jian-containing serum on proliferation of A549 cells （±s）

①P ＜0.05，②P ＜0.01，与空白对照组比较

组别空白对照组扶肺煎低剂量组扶肺煎高剂量组AG490组顺铂组干预24 h OD值1.02±0.02 0.97±0.02 0.91±0.04 0.88±0.02 0.87±0.03抑制率（%）0 5.29±0.04 10.6±0.01 13.9±0.03 14.9±0.02干预48 h OD值1.59±0.03 1.34±0.05①1.25±0.04①1.19±0.06②1.21±0.05①抑制率（%）0 15.8±0.02 21.3±0.01 25.4±0.04 23.3±0.03干预72 h OD值2.24±0.06 1.97±0.08 1.82±0.00①1.67±0.06②1.61±0.05②抑制率（%）0 12.3±0.01 18.6±0.04 25.0±0.07 27.9±0.06

表2 扶肺煎含药血清对SPC-A1细胞增殖的影响Table 2 Effect of Fufei Jian-containing serum on proliferation of SPC-A1 cells （±s）

表2 扶肺煎含药血清对SPC-A1细胞增殖的影响Table 2 Effect of Fufei Jian-containing serum on proliferation of SPC-A1 cells （±s）

①P ＜0.05，②P ＜0.01，与空白对照组比较

组别空白对照组扶肺煎低剂量组扶肺煎高剂量组AG490组顺铂组干预24 h OD值0.85±0.03 0.80±0.02 0.73±0.03 0.70±0.01 0.71±0.02抑制率（%）0 5.1±0.03 13.0±0.03 16.9±0.02 15.5±0.03干预48 h OD值1.46±0.04 1.28±0.03 1.14±0.04①1.15±0.06①1.24±0.03抑制率（%）0 12.0±0.02 21.8±0.01 21.0±0.04 15.0±0.03干预72 h OD值2.07±0.06 1.94±0.04 1.84±0.05 1.55±0.04②1.60±0.06①抑制率（%）0images/BZ_154_797_2053_799_2056.png0.06±0.06 11.1±0.01 25.4±0.03 22.7±0.04

2.2 扶肺煎含药血清对A549、SPC-A1 细胞迁移的影响 图1结果显示：扶肺煎高剂量组、AG490组、顺铂组处理A549、SPC-A1细胞划痕24 h后划痕依旧明显，宽度变化不明显，而空白对照组划痕区变窄。A549 细胞，与空白对照组比较，扶肺煎低、高剂量组，AG490 组、顺铂组细胞迁移距离明显缩短，差异均有统计学意义（P ＜0.01）；SPC-A1细胞，与空白对照组比较，扶肺煎高剂量组、AG490 组、顺铂组的细胞迁移距离均明显缩短，差异有统计学意义（P ＜0.01）。表明扶肺煎均可抑制A549、SPC-A1细胞的迁移。

2.3 扶肺煎含药血清对A549、SPC-A1 细胞侵袭能力的影响 图2 结果显示：A549 细胞，与空白对照组比较，扶肺煎低、高剂量组，AG490 组，顺铂组细胞迁移数量明显减少，差异均有统计学意义（P ＜0.01）；SPC-A1 细胞，与空白对照组比较，扶肺煎高剂量组、AG490 组、顺铂组的细胞迁移数量均明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.01）。表明扶肺煎均可抑制A549、SPC-A1 细胞的侵袭转移。

2.4 扶肺煎含药血清对A549、SPC-A1 细胞Cyclin D1、CDK4 蛋白表达的影响 图3 结果显示：A549 细胞，与空白对照组比较，扶肺煎低、高剂量组，AG490 组，顺铂组的Cyclin D1 蛋白表达水平明显降低，扶肺煎高剂量组及AG490 组的CDK4蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01）；SPC-A1细胞，与空白对照组比较，扶肺煎低、高剂量组，AG490 组、顺铂组的Cyclin D1、CDK4 蛋白表达水平均明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。表明扶肺煎可能通过抑制Cyclin D1、CDK4 的表达，抑制A549、SPC-A1细胞的侵袭转移。

2.5 扶肺煎含药血清对A549、SPC-A1细胞STAT3、p-STAT3 的影响 图4 结果显示：A549、SPC-A1细胞各组STAT3 表达水平比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05）。A549 细胞，扶肺煎高剂量组、AG490 组、顺铂组的p-STAT3 表达水平较空白对照组明显降低，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）；SPC-A1 细胞，扶肺煎高剂量组、AG490 组、顺铂组的p-STAT3 表达水平较空白对照组明显降低，但扶肺煎高剂量组差异无统计学意义（P ＞0.05）。表明扶肺煎可能通过抑制STAT3磷酸化，减轻A549、SPC-A1 细胞的侵袭转移能力，对A549细胞的抑制作用更强。

图1 扶肺煎含药血清对A549、SPC-A1细胞迁移的影响Figure 1 Effect of Fufei Jian-containing serum on migration of A549 and SPC-A1 cells

图2 扶肺煎含药血清对A549、SPC-A1细胞侵袭的影响Figure 2 Effect of Fufei Jian-containing serum on invasion of A549 and SPC-A1 cells

图3 扶肺煎含药血清对A549、SPC-A1细胞Cyclin D1、CDK4蛋白表达的影响Figure 3 Effect of Fufei Jian-containing serum on protein expression levels of Cyclin D1 and CDK4 in A549 and SPC-A1 cells

图4 扶肺煎含药血清对A549、SPC-A1细胞STAT3、p-STAT3的影响Figure 4 Effect of Fufei Jian-containing serum on the protein expression levels of STAT3 and p-STAT3 in A549 and SPC-A1 cells

2.6 扶肺煎对Lewis荷瘤小鼠移植瘤生长、肺转移情况的影响 图5、表3 结果显示：扶肺煎低、高剂量组及顺铂组Lewis荷瘤小鼠瘤质量较模型组明显减小（P ＜0.01），抑瘤率分别为46.81%、78.72%、76.60%；扶肺煎高剂量组、顺铂组的肺转移结节数量较模型组明显减少（P ＜0.01），肺转移抑制率分别为0.82%、28.76%、33.82%。表明扶肺煎可抑制Lewis荷瘤小鼠移植瘤生长与肺转移。

2.7 扶肺煎对Lewis 荷瘤小鼠肺脏病理形态学的影响 图6 结果显示：模型组Lewis 荷瘤小鼠肺泡壁存在损伤、断裂，且细胞浸润增加；肺泡间隙中性粒细胞增多，肺部存在肿瘤转移小结节；转移的肿瘤由长梭形或短梭形细胞形成，呈编织状排列；细胞核椭圆形，色深，核仁不明显，胞浆丰富。扶肺煎高剂量组上述情况相对较好。表明Lewis 荷瘤小鼠存在肺转移，扶肺煎可减轻Lewis荷瘤小鼠的肺转移。

2.8 扶肺煎对Lewis荷瘤小鼠移植瘤组织Cyclin D1、CDK4 蛋白表达的影响 图7 结果显示：与模型组比较，扶肺煎高剂量组及顺铂组移植瘤组织Cyclin D1、CDK4蛋白表达水平均降低（P ＜0.05或P ＜0.01），表明扶肺煎可抑制Lewis 荷瘤小鼠移植瘤细胞增殖。

图5 各组Lewis荷瘤小鼠移植瘤大小比较Figure 5 Comparison of the Xenograft tumors size in Lewis tumor-bearing mice of various groups

表3 各组Lewis荷瘤小鼠移植瘤生长、肺转移情况比较Table 3 Comparison of the Xenograft tumors growth and lung metastasis in Lewis tumor-bearing mice of various groups （±s）

表3 各组Lewis荷瘤小鼠移植瘤生长、肺转移情况比较Table 3 Comparison of the Xenograft tumors growth and lung metastasis in Lewis tumor-bearing mice of various groups （±s）

①P ＜0.01，与模型组比较

组别模型组扶肺煎低剂量组扶肺煎高剂量组顺铂组瘤质量（g）0.47±0.07 0.25±0.05①0.10±0.04①0.11±0.06①抑瘤率（%）—46.81 78.72 76.60肺转移结节（个）6.12±1.06 6.07±0.35 4.36±0.57①4.05±0.76①肺转移抑制率（%）—0.82 28.76 33.82

图6 扶肺煎对Lewis荷瘤小鼠肺脏病理形态学的影响（HE染色，×100）Figure 6 Effect of Fufei Jian on the pathological features of lung tissue in Lewis tumor-bearing mice of various groups（HE staining，×100）

2.9 扶肺煎对Lewis荷瘤小鼠移植瘤组织p-STAT3表达的影响 图8结果显示：与模型组比较，扶肺煎低、高剂量组及顺铂组移植瘤组织p-STAT3 蛋白表达水平均降低（P ＜0.05 或P ＜0.01），表明扶肺煎可能通过抑制STAT3 蛋白的活化发挥抑制肿瘤增殖、转移的作用。

3 讨论

扶肺煎为本院效验多年的抗肺癌验方。方中：生晒参益气补正，北沙参养阴生津，并为君药；黄芪助生晒参补气，枸杞子助北沙参养阴，猫爪草祛肺毒，俱为臣药；复以蜈蚣清热，紫花地丁散结，天葵子散瘀，兼具解毒之效，均系佐药。诸药伍用，共收扶正补虚、养阴解毒之功。由于A549 细胞具有较高的增殖、侵袭迁移能力[8]，而SPC-A1侵袭迁移能力相对较弱[9]，故本研究选择A549、SPC-A1细胞株为研究对象观察扶肺煎对其抑制作用，对扶肺煎抗肿瘤的药理学机制进行评价。本研究结果表明，扶肺煎可抑制A549、SPC-A1 细胞的增殖，抑制A549 细胞的效果优于抑制SPC-A1 细胞的效果，且可抑制2 种细胞的迁移、侵袭，提示扶肺煎可能对A549细胞更为敏感。

图7 各组Lewis小鼠肺癌移植瘤组织Cyclin D1、CDK4蛋白表达比较Figure 7 Effect of Fufei Jian on the protein expression levels of Cyclin D1 and CDK4 in Xenograft tumor tissue from Lewis tumor-bearing mice

图8 扶肺煎对Lewis荷瘤小鼠移植瘤组织p-STAT3表达的影响Figure 8 Effect of Fufei Jian on the protein expression level of p-STAT3 in Xenograft tumor tissue from Lewis tumorbearing mice

Lewis 肺癌模型广泛应用于癌转移机制及抗肿瘤药物的筛选与干预研究，是理想的动物实验模型。本研究结果显示：在Lewis 肺癌移植瘤小鼠中，扶肺煎高剂量组及顺铂组具有较高的抑瘤率及肺转移抑制率；各组小鼠肺部均存在肿瘤细胞转移的现象，其中，模型组肺泡壁存在损伤、断裂，且细胞浸润增加，扶肺煎高剂量组情况相对较好。表明扶肺煎对Lewis肺癌移植瘤具有一定的抑制作用。

肿瘤转移是一个非常复杂的过程。肿瘤细胞会侵入周围的细胞，破坏正常组织的抗癌机制，经过突变、激增等过程之后最终扩散至各个健康组织。有研究表明，在肿瘤转移过程中，Cyclin D1扮演着重要角色[10]。Cyclin D1 蛋白是由原癌基因CCNDl 编码的细胞周期调控蛋白，癌基因STAT3等可诱导癌细胞Cyclin D1 蛋白的表达，与CDK4、CDK6 形成复合物Cyclin D1/CDK4、CDK6，使Rb蛋白磷酸化，驱动细胞从G1 期进入S 期[11]。本研究结果显示，无论体外还是体内实验，扶肺煎均可降低Cyclin D1、CDK4蛋白的表达水平，表明其对肿瘤细胞周期调控蛋白具有较好的抑制效果。

STAT3在恶性肿瘤的发生、发展和浸润、转移中起着重要的调控作用。正常生理情况下，STAT3的表达是一个瞬时过程，一般呈微弱表达[12]。而STAT3 的持续高表达往往引起正常细胞的恶性转化[13]，STAT3 磷酸化并被激活后转移到细胞核内，通过SH2 结构域与Cyclin D1 启动子上的STAT3 位点结合而启动Cyclin D1 基因的表达[14]，同时也促进抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL[15-17]等表达，抑制肿瘤细胞凋亡，促进细胞周期进展，使弱转移肿瘤细胞转变为高转移癌细胞，并增加其在体内的癌转移。而AG490 作为STAT3 的抑制剂，可通过抑制STAT3的活化从而抑制肿瘤增殖[18]。本研究结果显示，扶肺煎可下调磷酸化STAT3 的体内外表达水平，效果接近STAT3 的抑制剂AG490。提示扶肺煎在体内可能通过抑制STAT3 的磷酸化水平，从而起到抑制肿瘤细胞增殖及迁移的作用。

综上所述，肺癌是目前人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，侵袭和转移是肺癌患者死亡的重要原因。STAT3信号通路、细胞周期蛋白表达的变化是非小细胞肺癌研究的一项重要内容。本研究结果表明，扶肺煎能够通过抑制STAT3 蛋白的活化，降低Cyclin D1、CDK4的表达，起到控制肿瘤细胞生长及分化的作用，从而干预肿瘤转移的形成，结合其临床应用价值，值得进一步深入研究。