张立田 徐淑媛 李艺 王雪松 董李学 李爱军 王磊

摘要：[目的]利用高效液相色谱-高分辨四级杆飞行时间质谱（HPLC-QTOF/MS）技术，建立饲料中35种有机磷类药物的快速筛查方法。[方法]饲料样品经乙腈-0.2%甲酸溶液提取，QuEChERS方法净化，建立了35种分析物的数据库。目标药物经WatersACQUITYUPLCHSST3色谱柱（50mm×2.1mm，1.8μm）分离，在正离子模式下进行数据采集，可在7min内实现对35种杀虫剂药物的良好分离。[结果]在10、50、100μg/kg添加浓度下的回收率为80.87%～114.21%，相对标准偏差（RSD）为3.69%～11.65%（n=6），方法定量限（LOQ，S/N=10）为0.2～0.5μg/kg，在5～100μg/L质量浓度范围内呈良好线性（R2≥0.9984）。结合精确质量数、保留时间和同位素峰形匹配度对目标化合物进行快速筛查与确证。[结论]该方法快速简便、准确、灵敏度较高，适用于饲料中有机磷类药物残留的高通量筛查与定性鉴定。

关键词：QuEChERS;饲料;有机磷类药物;高效液相色谱-串联飞行时间质谱

中图分类号S816.17文献标识码A文章编号0517-6611（2021）08-0199-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.052

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

ScreeningandDeterminationof35OrganophosphorusDrugsinFeedbyQuEChERSMethodCombinedwithPerformanceLiquidChromatography-Time-of-FlightMassSpectrometry

ZHANGLi-tian1，2，3，XUShu-yuan1，2，3，LIYi1，2，3etal

（1.TangshanFoodandDrugComprehensiveTestingCenter，Tangshan，Hebei063000;2.HebeiAgriculturalProductsQualityandSafetyTestingInnovationCenter，Tangshan，Hebei063000;3.TangshanInstituteofIndustrialTechnologyforFunctionalAgriculturalProducts，Tangshan，Hebei063000）

Abstract[Objective]Acomprehensiveanalyticalmethodwasestablishedforthesimultaneousdeterminationof32organophosphatesinfeedbyperformanceliquidchromatography-quadrupoletime-of-flightmassspectrometry（HPLC-QTOF/MS）.[Method]Theanalytesinfeedsampleswereextractedwithacetonitrilecontaining0.2%formicacid.TheextractswerecleanedupthroughQuEChERSmethodandadatabasefor35targetanatyteswasestablished.ThetargetcompoundswereseparatedonanWatersACQUITYUPLCHSST3columnanddetectedbyMSinDualAJSESI+mode.The35pesticidescouldbeseparatedin7min.[Result]Therecoveriesof35pesticideswere85.98%-114.21%andRSDwas0.58%-11.65%attheconcentrationsof10，50and100μg/kg.Thequantitativelimitoftheexperimentalmethodwas0.2-0.5μg/kgandallthepesticidestobetestedwereinthecalibrationcurvesrangeof5-100μg/Lwithshowedagoodlinearity（R2≥0.9984）.Theprecisionmass，retentiontimeandisotopicmatched-degreewereemployedforthescreeningandconfirmation.[Conclusion]Themethodisfast，simple，accurate，andhighlysensitive，andissuitableforhigh-throughputscreeningandqualitativeidentificationoforganophosphorusdrugresiduesinfeed.

KeywordsQuEChERS;Feed;Organophosphatesdrugs;Performanceliquidchromatography-time-flight-massspectrometry（HPLC-QTOF/MS）

有機磷农药具有高效、低毒和生物降解快的特点，因而被广泛用于粮食、棉花、蔬菜、果树等作物的害虫防治。但是杀虫剂药物在动物产品中的残留不仅危害到消费者的身体健康，对人体产生诸如具有致突变性和潜在的致癌性等毒副作用，引起细菌耐药性的增加，而且同时影响我国畜禽产品的出口贸易[1-4]。为了保护人民的身体健康，从源头进行控制的有效手段，因此研究饲料中有机磷药物的检测方法具有重要的意义。

针对饲料中有机磷类药物的检测手段比较单一，测定饲料中有机磷药物残留的HPLC法、GC-MS法、SDME-GC-MS法、LC-MS法、HPLC-MS/MS等分析方法已经不适用实际样

品快速筛查的需要。高效液相色谱-高分辨四级杆飞行时间质谱（HPLC-QTOF/MS）法具有更强的分离能力、样品通量和灵敏度，可以提供母离子和碎片离子的精确质量数，准确推算可能的分子式，从而进一步对化合物的结构和裂解规律加以确证[5-11]。该试验利用HPLC-QTOF/MS技术，建立了35种有机磷类药物的饲料样品前处理方法和质谱特征数据库，采用FullScan/MSE模式进行扫描测定，不仅提高了有机磷类药物残留的快速筛查的可靠性，同时可以获得较高灵敏度的定量结果，从而为饲料样品的快速高通量筛查提供准确、可靠的方法。

1材料与方法

1.1仪器与设备

TripleTOF5600MS仪（配有电喷雾离子源），美国ABSCIEX公司;SiO-6512全自动前处理设备，本立科技公司;SZ13022-NY0.2μm有机滤膜，天津市领航实验设备股份有限公司;T-200电子天平，常熟双杰仪器制造厂;FY-DCY96S氮气浓缩仪，上海安谱实验科技股份有限公司;Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司。

1.2材料与试剂

青贮玉米。甲酸（UV-HPLC级）、乙腈（UV-HPLC级）、甲酸铵，纯度>99.0%，Dikma公司;无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸氢二钠、柠檬酸钠、N-丙基乙二胺（PSA）、氧化锆珠（R104）和双层提取净化管（V50），均购于本立科技公司;去离子水（自制）;敌敌畏、乐果、氧乐果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、除线磷、辛硫磷、三唑磷、二嗪磷、地虫硫磷、杀螟松、丙溴磷、乙硫磷、蝇毒磷、甲胺磷、治螟磷、久效磷、对硫磷、杀扑磷、地胺磷、伏杀硫磷、磷铵、马拉硫磷、水胺硫磷、喹硫磷、硫环磷、敌百虫、甲基异柳磷、稻丰散、亚胺硫磷、灭线磷、甲基对硫磷、特丁硫磷，100μg/mL，纯度995%，天津阿尔塔科技有限公司。

1.3试验方法

1.3.1样品前处理。

准确称取2.0g饲料样品于离心管外管中，加入混合标准溶液，静置30min，加入10mL乙腈和10mL水，加入萃取盐包（内含5.5g无水硫酸镁、1.5g氯化钠、0.5g柠檬酸氢二钠、1.0g柠檬酸钠）及10颗锆珠，拧紧内管（内含4mm氧化锆珠5粒、100mgPSA、600mg无水硫酸镁、100mgC18）后放入自动QuEChERS前处理仪器中开始处理，经25min交替振荡离心后，从内管中取净化液过0.22μm的有机微孔滤膜，滤液供HPLC-QTOF/MS测定。

1.3.2色谱-质谱分析条件。

1.3.2.1

色谱条件。流动相A为0.1%（V/V）甲酸+2mmol/L甲酸铵的水溶液，B为0.1%甲酸+2mmol/L甲酸铵的甲醇溶液。梯度洗脱：0～0.5min，5%B;0.5～1.0min，30%B;1.0～10.0min，95%B;10.0～13.0min，5%B。進样量5μL;流速0.3mL/min;柱温40℃;样品温度10℃;WatersACQUITYUPLCHSST3色谱柱（50mm×2.1mm，1.8μm）。

1.3.2.2

质谱条件。正离子采集模式;离子源温度500℃;电喷雾电压5.5kV;气帘气压力241.32kPa;扫描模式FullScan/MSE，采集范围m/z80～1000，采集时间0.75s，采集间隔时间10s。

1.4筛查数据库的建立

取合适浓度的混合标准工作液稀释至1μg/mL，在优化色谱-质谱条件下，先进行一级质谱扫描，得到目标化合物的保留时间、质子化的分子质量数、质量误差等信息。在不同的碰撞电压下再进行二级质谱扫描，得到目标化合物的二级全扫描图及质谱碎片信息，以此建立35种杀虫剂类药物的筛查谱库。筛查谱库中还包含药物的英文名称、分子式、结构式、理论分子量、保留时间以及同位素峰型匹配度等信息。根据谱库信息可对样品中目标化合物进行筛查确证。

2结果与分析

2.1色谱-质谱条件优化

2.1.1色谱条件。

试验选用WatersACQUITYUPLCHSST3色谱柱分析，考察了0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、2mmol/L甲酸铵-乙腈、2mmol/L甲酸铵-甲醇和0.1%甲酸+2mmol/L甲酸铵-甲醇5种流动相对杀虫剂类的分离、离子化效应和峰形的影响。甲酸铵体系可以获得较低的背景值，但杀虫剂类药物响应较低，影响检测灵敏度。采用甲酸体系时，背景值有所升高，但35种目标药物的响应有所增强。与乙腈相比，甲醇作为流动相可以获得更好的分离度。综合分析，试验采用0.1%甲酸+2mmol/L甲酸铵-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，7min内实现35种目标分析物的基线分离。目标分析物在溶剂中的总离子流色谱图如图1所示。

2.1.2质谱条件。

有机磷类药物均含有易于和H+结合的带有孤对电子的O原子，适合在ESI源的正离子模式下离子化，其准分子离子为[M+H]+。考察了电喷雾电压、气帘气压力、碰撞能和离子源温度等因素的影响。离子源温度500℃、电喷雾电压5.5kV和气帘气压力241.32kPa时，目标化合物的响应较强。高分辨Q-TOF质谱在FullScan/MSE模式下能同时完成在低能通道以母离子为定量离子，又能实现在高能通道全范围二级质谱的扫描，有助于样品的快速筛查和定量分析。

2.2线性关系、精密度和回收率

以空白饲料样品制备浓度为5、10、20、40、80、100μg/L的基质标准样品，在优化的色谱和质谱条件下进行测定，以各组分的峰面积对其质量浓度绘制标准曲线，计算线性方程、线性范围和决定系数（R2），以10倍信噪比（S/N=10）估算定量限（LOQ），具体结果如表1所示。从表1可以看出，35种有机磷类药物的LOQ为0.2～0.5μg/kg，在5～100μg/L质量浓度范围内线性关系良好（R2≥0.9984）。

利用空白饲料样品进行加标回收率试验，分别对低（10μg/kg）、中（50μg/kg）、高（100μg/kg）3个添加水平按照“1.3.1”方法处理，每个浓度水平做6份平行样品，结果见表2。由表2可知，低加标水平下，杀虫剂类药物的平均回收率>80%，RSD<12%;中、高加标水平下，有机磷类药物的平均回收率>86%，RSD<9%。表明有机磷类药物在低浓度水平受基质干扰较大;在中、高浓度水平重现性较好，方法准确可靠。

2.3数据库的建立与筛查

在最佳的色譜-质谱条件下，对每一种目标化合物的标准品进行FullScan/MSE扫描，基于HPLC-QTOF/MS的高通量筛查研究，采用MasslynxChromlynx软件建立了有机磷类药物的高通量筛查数据库，其包括目标化合物的分子式、精确分子量、保留时间和同位素峰形匹配度等信息（表3），通过比对以上信息，所有35种目标化合物的保留时间偏差均<±0.01min，质量偏差均<±4mDa，同位素峰形匹配度>90%。

2.4实际样品检测

应用该研究建立的HPLC-QTOF/MS的高通量筛查方法，随机抽取20份饲料样品进行检测，采集一级质谱数据、保留时间和二级碎片信息对样品中35种有机磷类药物定性筛查同时定量，均未检出阳性样品。

3结论

该研究建立了HPLC-QTOF/MS测定饲料中35种有机磷类药物的检测方法和目标化合物的数据库，并进行了方法学验证。在10、50、100μg/kg添加浓度下的回收率为8087%～114.21%，相对标准偏差（RSD）为3.69%～11.65%（n=6），方法定量限（LOQ，S/N=10）为0.2～0.5μg/kg，在5～100μg/L质量浓度范围内呈良好线性（R2≥0.9984）。该方法具有简便高效快速、选择性好、灵敏准确等特点，满足测定大量饲料样品中有机磷类药物的快速、定量的需求，适用于饲料中有机磷类药物的同时定性筛查和定量分析。

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