侯小涛，韦棪婷，夏中尚，韦 玮，郝二伟，杜正彩，周月敏，邓家刚*

基于血清药物化学的厚藤治疗急性痛风性关节炎质量标志物研究

侯小涛1, 2，韦棪婷1, 2，夏中尚2, 3，韦 玮2，郝二伟2，杜正彩2，周月敏1，邓家刚2*

1. 广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200 2. 广西中医药大学 广西中药药效研究重点实验室，广西 南宁 530200 3. 成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

基于中药质量标志物（quality marker，Q-Marker）的概念，研究厚藤提取物对急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）大鼠的治疗作用，并分析厚藤提取物在正常大鼠及AGA大鼠的血中移行成分，为厚藤Q-Marker的确定提供依据。采用尿酸钠建立AGA大鼠模型，考察厚藤提取物对AGA大鼠关节肿胀指数、足垫肿胀程度和滑膜组织病理变化的影响，考察厚藤提取物对AGA大鼠血清中白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）和MIP-2水平的影响。采用液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF-MS/MS）技术对厚藤提取物进行定性分析，探寻正常大鼠和AGA大鼠ig厚藤提取物后的入血成分。与模型组比较，厚藤提取物组大鼠关节肿胀指数和足垫厚度均显著降低（＜0.05、0.01），厚藤提取物高、中剂量组大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平均显著降低（＜0.05），厚藤提取物高、中剂量组大鼠滑膜组织炎性细胞浸润减轻。从厚藤提取物中鉴定出树脂糖苷类、黄酮类、有机酸类、香豆素类、核苷类、木脂素类等53个成分，其中有机酸类和黄酮类为其主要成分，并推测了树脂糖苷类、黄酮类、有机酸类、香豆素类部分成分的裂解规律；正常大鼠含药血浆中鉴定出苹果酸、咖啡酸、咖啡酸甲酯和对羟基苯甲酸4个成分，AGA大鼠含药血浆中鉴定出莨菪亭、咖啡酸、咖啡酸甲酯和对羟基苯甲酸4个成分。厚藤提取物能够明显改善AGA大鼠关节肿胀，抑制血清中IL-1β、MIP-1α及MIP-2水平，并抑制炎症反应；采用LC-Q-TOF-MS/MS技术可快速鉴定厚藤水提物的主要成分为有机酸类和黄酮类，莨菪亭、咖啡酸、绿原酸及其异构体（新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C）和原儿茶酸在AGA大鼠中以原型成分或代谢物形式入血，可作为厚藤治疗AGA的Q-Marker。

厚藤；急性痛风性关节炎；质量标志物；液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱；莨菪亭；咖啡酸；绿原酸；新绿原酸；隐绿原酸；异绿原酸B；异绿原酸A；异绿原酸C；原儿茶酸

痛风是嘌呤代谢紊乱造成皮下组织、关节周围、骨骼及尿路中尿酸盐结晶沉淀而引发的病变，我国痛风发病率1%～3%，为仅次于糖尿病的第2大代谢类疾病[1-2]。急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）是痛风急性发作期的首发症状，其发病机制与炎症反应和高尿酸血症密切相关[3]。目前临床上针对AGA的化学药物多为秋水仙碱、非甾体类抗炎药物、糖皮质激素等[4]，普遍存在不良反应，临床应用上受到一定的限制。目前越来越多的研究从中西医结合的途径入手，探索中医药在治疗AGA的优势。

厚藤(Linn.) Sweet为旋花科番薯属植物，是我国南方沿海地区常用的海洋中药，其味辛、苦，性微寒，归肺、肝、胃、大肠经，具有祛风除湿、消痈散结、拔毒消肿的功效，常用于治疗腰肌劳损、风湿关节痛等疾病[5-6]。厚藤具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等多种药理活性[7]。抗炎活性与厚藤祛湿拔毒等传统功效密切相关，被认为是其主要的药效作用。目前其抗炎活性研究多停留在验证传统功效层面，未见对其作用机制进行深入研究的报道，也未见对其化学成分与药理作用之间关联性进行研究的报道。基于刘昌孝院士[8]提出质量标志物（quality marker，Q-Marker）的概念，本研究利用液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF-MS/MS）技术，在药物有效的前提下，分别对正常大鼠和AGA大鼠ig厚藤提取物后的含药血浆进行分析，为厚藤Q-Marker的确定及其药材的质量标准研究提供依据和思路。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体质量（200±10）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。动物饲养于温度（23±2）℃、湿度50%～60%、12 h/12 h昼夜交替光照的环境中，自由进食饮水。动物实验经广西中医药大学动物伦理委员会批准（批准号DW20190418-015）。

1.2 药材

厚藤于2019年4月20日采自广西防城港市北仑河口国家级自然保护区，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为旋花科植物厚藤(L.) Sweet。

1.3 药品与试剂

尿酸钠（批号U2875-5G）购自美国Sigma公司；秋水仙碱片（批号180101）购自西双版纳版纳药业公司；4%多聚甲醛（批号70120900）购自Biosharp公司；EDTA脱钙液（批号E1171）购自北京索莱宝科技有限公司；白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）、MIP-2多因子试剂盒（批号64325505）购自美国BIO-RAD公司；质谱级甲醇、乙腈购自美国Thermo Fisher Scientific公司）；色谱级甲酸购自日本TCI公司；异槲皮苷对照品（批号DST180108-006）购自德思特生物公司；绿原酸对照品（批号AF8112791）购自成都埃法生物科技公司；异莨菪亭对照品（批号PS020323）购自成都普思生物科技公司）；阿魏酸对照品（批号MUST-18032928）购自成都曼思特生物公司；对照品秦皮乙素（批号190329）、异绿原酸C（批号190507）、异绿原酸A（批号190423）、异绿原酸B（批号160822）、咖啡酸（批号160803）购自上海融禾医药科技有限公司；以上对照品质量分数均≥98%。

1.4 仪器

ExionLC AC液相色谱仪、X500R QTOF质谱仪、SCIEX OS 2.0数据处理软件（美国SCIEX公司）；CPA225D万分之一天平（德国赛多利斯科学仪器北京公司）；KQ-500DE型数控超声仪（昆山市超声仪器公司）；Hei-VAP型旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；TGL-16M型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；X-200 Luminex多功能流式点阵仪（美国Luminex公司）。

2 方法

2.1 厚藤提取物的制备

称取厚藤地上部分粗段，加入12倍量水煮沸后再煎30 min，滤过；再加入10倍量水提取1次，合并2次滤液，55 ℃减压浓缩至稠膏。

2.2 动物分组、造模与给药

大鼠随机分为对照组、模型组、秋水仙碱（0.27 mg/kg）组和厚藤提取物高、中、低剂量（928.80、464.40、222.90 mg/kg，分别相当于成人每日服用生药材50、25、12 g）组，每组10只，另随机选取3只作为正常给药组。各给药组ig相应药物，正常给药组ig厚藤提取物（928.80 mg/kg），对照组和模型组ig等体积纯化水，1次/d，连续7 d。第7天给药1 h后，大鼠ip 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，正常给药组和对照组大鼠于右后侧踝关节腔注射0.1 mL无菌生理盐水，其余各组大鼠于右后侧踝关节腔注射0.1 mL尿酸钠溶液（0.5 g/10 mL），建立AGA模型[9]。造模后，各给药组ig相应药物，1次/d，连续2 d。

2.3 厚藤提取物对AGA大鼠踝关节肿胀指数和右后足垫厚度的影响

造模后观察各组大鼠关节肿胀和右后足垫肿胀程度，并计算关节肿胀指数。

关节肿胀指数＝测定时间点关节周径－初始关节周径

2.4 厚藤提取物对AGA大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平的影响

大鼠禁食不禁水12 h，末次给药后1 h，腹主动脉采血至含肝素钠的采血管中，3000 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定各组大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平。

2.5 厚藤提取物对AGA大鼠滑膜组织病理变化的影响

大鼠脱颈椎处死，取各组大鼠踝关节滑膜组织，浸泡于4%多聚甲醛中，脱钙后包埋于石蜡中制成组织块，随后采用苏木精-伊红（HE）染色，显微镜下观察滑膜组织病理变化。

2.6 供试品溶液的制备

取适量厚藤提取物稠膏于蒸发皿中，55 ℃水浴烘干，取0.1 g提取物粉末，精密称定，加入20 mL 50%甲醇，密塞称定质量，超声提取30 min，冷却至室温后再次称定质量，以50%甲醇补足质量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.7 对照品溶液的制备

分别取秦皮乙素、咖啡酸、异槲皮苷、异莨菪亭、绿原酸对照品适量，精密称定，加入甲醇配制成各成分质量浓度为10 µg/mL的混合对照品溶液。分别取异绿原酸C、异绿原酸B、异绿原酸A、阿魏酸适量，加入甲醇配制成质量浓度为10 µg/mL的对照品溶液。

2.8 血浆样品的制备

将正常给药组、对照组、模型组、厚藤提取物高剂量组同组血浆混合，各吸取1 mL，加入3倍量甲醇-乙腈（1∶1）溶液沉淀蛋白，涡旋3 min，4 ℃、15 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，氮气吹干至固状，残渣加入200 μL甲醇，超声3 min，涡旋混匀1 min，4 ℃、15 000 r/min离心10 min，吸取上清液进行分析。

2.9 厚藤成分库的建立

通过CNKI、PubMed等数据库检索与厚藤相关的文献，对厚藤的化学成分进行总结，共检索到119个化学成分；利用ChemBioDraw软件、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Chemicalbook（https://m.chemicalbook.com/）等平台收集化学成分的名称、分子式、结构式、相对分子质量等信息。

2.10 色谱条件

Hypersil Gold色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 µm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），洗脱程序：0～30 min，5%～95% B；体积流量为0.4 mL/min；进样量为3 µL；柱温为40 ℃。

2.11 质谱条件

双喷雾TurboV离子源；正/负离子扫描方式；扫描范围为/100～1500；正离子源电压为5500 V，负离子源电压为−4500 V；离子源温度为600 ℃；雾化气压力为55 psi（1 psi＝6.895 kPa），辅助气压力为55 psi，气帘气压力为35 psi；母离子碰撞能量为−10 V；去簇电压为−80 V；子离子碰撞能量为−35 V。

2.12 数据处理

3 结果

3.1 厚藤提取物对AGA大鼠踝关节肿胀指数的影响

如表1所示，与对照组比较，造模后第4～24小时，模型组大鼠踝关节肿胀指数显著升高（＜0.01），于造模后第12小时达到肿胀高峰。与模型组比较，造模后第24～48小时，厚藤提取物组大鼠踝关节肿胀指数显著降低（＜0.05、0.01）。

3.2 厚藤提取物对AGA大鼠右后足垫厚度的影响

如表2所示，与对照组比较，造模后第4～24小时，模型组大鼠右后足垫厚度显著增加（＜0.01）；与模型组比较，造模后第8、24小时，厚藤提取物组大鼠右后足垫厚度显著降低（＜0.05、0.01）。

3.3 厚藤提取物对AGA大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平的影响

如表3所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平显著升高（＜0.05、0.01）；与模型组比较，厚藤提取物高、中剂量组大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平显著降低（＜0.05）。

表1 厚藤提取物对AGA大鼠踝关节肿胀指数的影响()

与对照组比较：#＜0.05##＜0.01；与模型组比较：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

表2 厚藤提取物对AGA大鼠右后足垫厚度的影响()

表3 厚藤提取物对AGA大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平的影响()

3.4 厚藤提取物对AGA大鼠滑膜组织病理变化的影响

如图1所示，对照组大鼠滑膜结构清晰完整，滑膜组织无炎性细胞浸润及纤维组织增生；模型组大鼠滑膜衬里层较多炎性细胞浸润，以核分叶的中性粒细胞和圆形深染的淋巴细胞为主，有少量滑膜细胞变性坏死，坏死细胞核固缩或崩解、胞质淡染，血管轻度充血且扩张，管腔内充斥大量红细胞；秋水仙碱组和厚藤提取物高、中剂量组大鼠滑膜结构较清晰，少量衬里层组织脱落，衬里层内炎性细胞浸润明显减轻；厚藤提取物低剂量组大鼠滑膜仍有轻度充血及炎性细胞浸润现象。

图1 厚藤提取物对AGA大鼠滑膜组织病理变化的影响(HE, ×400)

3.5 厚藤提取物中的化学成分及其质谱裂解规律解析

采用LC-Q-TOF-MS/MS技术，参照厚藤成分库、SCIEX数据库、对照品比对及现有文献报道，对厚藤提取物中的主要成分进行分析，共鉴定出53个化学成分，包括树脂糖苷类成分3个、黄酮类成分10个、有机酸类成分26个、香豆素类成分5个、核苷类成分2个、氨基酸类成分2个、萜类成分2个、木脂素类成分1个、刺五加苷类成分1个和维生素类成分1个，并推测了部分化学成分的裂解途径。厚藤提取物总离子流图见图2，鉴定成分及碎片信息见表4。

图2 负离子模式(A) 和正离子模式(B)下厚藤水提取物的总离子流图

表4 厚藤提取物中化学成分的鉴定

续表4

续表4

3.5.1 树脂糖苷类化合物质谱分析 树脂糖苷类化合物又称大环内酯类化合物，其结构复杂，一般由长链脂肪酸作为苷元与不同数量、种类的单糖形成内酯，主要分布于旋花科番薯属植物中[29]。以pescapreins XXX为例，负离子模式下，得到/1 267.705 3 [M＋FA－H]－的准分子离子峰；二级碎片离子/1 221.700 4为丢失甲酸形成的[M－H]－的离子峰，/1 049.557 3为丢失一长链脂肪酸形成的碎片离子[M－H－C10H20O2]－，/417.285 8为/1 049.557 3发生糖苷键断裂形成的[M－H－C10H20O2－C29H44O15]－的碎片离子，/163.061 6为/417.285 8丢失长链脂肪酸形成的[M－H－C10H20O2－C29H44O15－C16H30O2]－；根据该化合物的精确相对分子质量、二级碎片裂解方式，鉴定为pescapreins XXX，其二级质谱图见图3，可能的裂解途径见图4。

图3 pescapreins XXX的二级质谱图

图4 pescapreins XXX的质谱主要断裂途径

3.5.2 黄酮类化合物质谱分析 黄酮类化合物在自然界广泛存在，是中草药的主要有效成分之一。以化合物32、33为例，在负离子模式下，R分别为5.52、5.66 min，分别得到/463.086 1 [M－H]－和/463.086 7 [M－H]－的准分子离子峰，在二级质谱信息中都具有/300、301、271、255的碎片，分别对应[M－H－Glc－H]－、[M－H－Glc]－、[M－H－Glc－CO－2H]－、[M－H－Glc－CO－OH－H]－，根据其裂解规律文献对照[22]推测为异槲皮苷或槲皮素-7--β--葡萄糖苷，因R不同，依据反相色谱柱洗脱原理，鉴定化合物32为异槲皮苷，化合物33为槲皮素-7--β--葡萄糖苷，其二级质谱图见5，以异槲皮苷为例，可能的裂解途径见图6。

3.5.3 有机酸类化合物质谱分析 厚藤含有的有机酸类成分较多，主要为2～3种成分的同分异构体及其衍生物的奎尼酸类成分，在二级质谱中容易丢失H2O、CO2等分子。化合物37、38、42的R分别为6.24、6.35、6.94 min，在负离子模式下，得到相同/515 [M－H]－的分子离子峰，在二级质谱中，因失去2个咖啡酰基，具有/353、191、179、173的特征性碎片离子，推测为异绿原酸。异绿原酸B对照品的R为6.14 min，异绿原酸A对照品的R为6.26 min，异绿原酸C对照品的R为6.80 min，都具有/353、191、179、173、135的二级碎片，根据与对照品比对、反相色谱柱洗脱原理及文献对照[20]，推测化合物37、38、42分别为异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C。以异绿原酸A为例，其二级质谱图见图7，可能的断裂途径见图8。

图5 异槲皮苷(A)和槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(B) 的二级质谱

图7 异绿原酸A的二级质谱图

图8 异绿原酸A的质谱主要断裂途径

3.5.4 香豆素类化合物质谱分析 以化合物12为例，R为2.50 min，准分子离子峰为/339.072 7 [M－H]－，二级质谱信息显示有/177.019 5、133.030 4，是由准分子离子丢失1个Glc，继续丢失1个CO2形成的碎片离子，根据该化合物一级质谱信息、二级裂解方式及文献报道[10]，鉴定为秦皮甲素，其二级质谱图见图9，可能的裂解途径见图10。

化合物28的R为5.09 min，在正离子模式下得到/193.048 9 [M＋H]＋的准分子离子峰，以该母离子进行MS/MS扫描，得到二级碎片离子/178.028 0，为准分子离子丢失1分子CH3形成；碎片离子/133.029 9为准分子离子丢失1分子CH3OH继而丢失1分子CO形成；碎片离子/150.033 2为母离子丢失1分子CH3后，再丢失1分子CO形成，继续丢失1分子CO形成/122.038 1的离子碎片。根据以上裂解方式，结合对照品及文献比对[14]，鉴定该化合物为异莨菪亭。其二级质谱图见图11，可能的裂解途径见图12。

图9 秦皮甲素的二级质谱图

图10 秦皮甲素的质谱主要断裂途径

3.6 厚藤在正常及AGA大鼠中入血成分鉴定

将对照组、正常给药组、模型组、厚藤高剂量组血浆样品分别在正、负离子模式下进行分析，给药组得到的数据扣除对照组的内源性成分，筛选只含在给药组血浆样品而不在对照组血浆样品的成分为入血成分；同理，厚藤高剂量组得到的数据扣除模型组的内源性成分。将入血成分的精确相对分子质量、二级碎片等信息与厚藤提取物鉴定结果比对，若一致，则为原型入血成分。从正常给药组初步鉴定4个入血成分，从厚藤提取物高剂量组初步鉴定出4个入血成分，2组中相同成分有3个。入血成分鉴定信息见表5、6，总离子流图见图13、14，提取离子流色谱图见图15、16。

3.7 厚藤在正常及AGA大鼠中入血成分分析

正常大鼠血浆中，R为0.69 min的化合物在负离子模式下，得到/133.0146 [M－H]－的准分子离子峰，其二级碎片主要有/115.005 7 [M－H－H2O]－、/71.014 5 [M－H－H2O－COOH]－，根据该化合物精确相对分子质量、二级质谱信息，并和厚藤提取物鉴定结果比对，鉴定为苹果酸，其二级质谱图见图17。R为2.87 min的化合物在负离子模式下，得到/179.035 3 [M－H]－的准分子离子峰，二级质谱信息显示主要有/135.0450 [M－H－COOH]－，根据该化合物精确相对分子质量、二级质谱信息，并和厚藤提取物鉴定结果比对，鉴定为咖啡酸，其二级质谱图见图17。R为3.04 min的化合物在负离子模式下，得到/193.050 6 [M－H]－的准分子离子峰，比咖啡酸准分子离子峰/179 [M－H]－多14，提示增加1个CH2，发生甲基化反应，结合二级碎片信息/178.025 7 [M－H－CH3]－、/134.037 4 [M－H－CO2－CH3]－，与咖啡酸二级质谱信息比较，符合咖啡酸甲基化过程。根据该化合物一级质谱信息、二级质谱信息并与文献比对，鉴定为咖啡酸甲酯[30]，其二级质谱图见图17。R为6.31 min的化合物在负离子模式下，得到/137.024 5 [M－H]－的准分子离子峰，二级碎片主要有/93.034 9 [M－H－CO2]－、/65.040 0 [M－H－CO2－CO]－，根据该化合物一级质谱信息、二级质谱信息并与文献对照[31]，鉴定为对羟基苯甲酸，推测为单咖啡酰基奎宁酸类（绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸）在体内代谢成奎尼酸而进一步代谢生成对羟基苯甲酸[32-33]，或是原儿茶酸在体内发生去羟基化反应生成，其二级质谱图见图17。

图11 异莨菪亭的二级质谱图

图12 异莨菪亭的质谱主要断裂途径

表5 厚藤提取物在正常大鼠中入血成分鉴定结果

表6 厚藤提取物在AGA大鼠中入血成分鉴定结果

图13 负离子模式下对照组(A)、空白给药组(B)、模型组(C) 和厚藤提取物高剂量组(D) 血浆样本的总离子流图

图14 正离子模式下对照组(A)、空白给药组(B)、模型组(C) 和厚藤提取物高剂量组(D) 血浆样本的总离子流图

图15 厚藤提取物在正常大鼠中入血成分的提取离子流色谱图

图16 厚藤提取物在AGA大鼠中入血成分的提取离子流色谱图

AGA大鼠血浆中，R为3.02的化合物在正离子模式下，得到/193.050 1 [M＋H]＋的准分子离子峰，其二级碎片主要有/178.026 8 [M＋H－CH3]＋、/150.033 0 [M＋H－CH3－CO]＋、/133.030 7 [M＋H－CH3－CO2]＋，根据该化合物精确相对分子质量、二级质谱信息，并与厚藤提取物鉴定结果比对，鉴定为莨菪亭，其二级质谱图见图17。AGA大鼠中移行成分除莨菪亭外，其余鉴定成分均与厚藤提取物在正常大鼠血浆中移行成分一致。

4 讨论

AGA是尿酸钠晶体沉积所致的关节疾病，临床表现为关节红、肿、热、痛，在中医属“痹证”等范畴[34-35]。其发病机制主要涉及代谢、免疫调节与炎症反应。单钠尿酸盐作为危险信号，可活化含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLR family Pyrin domain containing protein 3，NLRP3）炎症小体，产生大量IL-1β，引起炎症反应[36]，IL-1β在AGA的发病过程中起着关键作用。单钠尿酸盐晶体可迅速诱导巨噬细胞趋化因子MIP-1α、MIP-2水平升高，促使巨噬细胞活化[37]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠关节、足垫显著肿胀，血清中IL-1β、MIP-1α、MIP-2水平均升高，滑膜组织有较多炎性细胞浸润、血管充血现象，表明AGA模型制备成功；与模型组比较，秋水仙碱组和厚藤提取物高、中剂量组大鼠关节及足垫肿胀明显缓解，血清中IL-1β、MIP-1α、MIP-2水平均降低，滑膜炎性细胞浸润减轻，表明厚藤提取物可抑制AGA大鼠炎症反应。

传统中药为口服中药，口服药进入机体后经历复杂的代谢过程，只有吸收入血的成分才可能发挥药效。中药血清药物化学的概念，为研究中药药效的物质基础研究提供了科学方法[38]。本研究采用LC-Q-TOF-MS/MS技术首先对厚藤提取物中的化学成分进行表征，继而对厚藤提取物在正常大鼠及AGA大鼠中的入血成分进行分析，结果表明，厚藤提取物中主要成分为有机酸类化合物，其中主要包括咖啡酸、绿原酸、异绿原酸等奎尼酸类化合物及其衍生物，其次为山柰酚、异槲皮苷等黄酮类化合物。有机酸类[39]和黄酮类[40]成分具有抗炎活性，与厚藤的传统药效吻合。中药血清药物化学研究的给药设计、采血时间及采血方式有多种，本研究采取与厚藤提取物高剂量组同等剂量、1次/d、连续7 d的给药方式，确保中药绝大多数成分在体内血药浓度维持在一个基本稳定的水平。研究发现[41]，最佳的采血时间是在动物给药后0.5～2 h。采血方式通常有腹主动脉采血、眼眶静脉丛采血等方法。腹主动脉采血可获得大量血液且不易发生溶血，适用于单次采血；眼眶静脉丛采血可实现短时间内多次取血，但采血量较少。因考虑与厚藤提取物在AGA大鼠入血成分研究的采血方式平行，若采用眼眶静脉丛多次采血可能会对大鼠产生炎症或应激反应的影响，且AGA为急性模型，大鼠会出现自愈现象，不能确保末次采血时动物维持在病理状态。综上，本研究采取末次给药后1 h腹主动脉采血。ig厚藤提取物后，从正常大鼠血浆中鉴定出苹果酸、咖啡酸、咖啡酸甲酯、对羟基苯甲酸4种成分；在AGA大鼠血浆中鉴定出咖啡酸、莨菪亭、咖啡酸甲酯、对羟基苯甲酸4种成分，除莨菪亭外，其余成分均与厚藤提取物在正常大鼠血浆中移行成分一致。造成上述情况的原因可能是大鼠在正常状态和病理状态下对药物的吸收有一定差异[42]。在病理状态下检测厚藤入血成分更能体现药物临床病理状态下体内过程的特点。其中，莨菪亭为原型成分吸收入血，咖啡酸不仅是厚藤中的化学成分，也是绿原酸及其异构体（新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C）水解后的代谢产物[32-33,43]，咖啡酸甲酯为咖啡酸发生甲基化反应形成，对羟基苯甲酸可由单咖啡酰基奎宁酸类代谢产生或由原儿茶酸发生去羟基化反应生成。因此，莨菪亭、咖啡酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C及原儿茶酸可作为厚藤治疗AGA的Q-Marker。研究发现，咖啡酸可有效缓解类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）大鼠足肿胀和炎症细胞浸润，降低足跖中核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、壳多糖酶3样蛋白1（chitinase-3-like protein 1，CHI3L1）、IL-1β、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表达，从而发挥抗RA作用[44]。原儿茶酸能够抑制NF-κB和蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白（Akt/mTOR）信号通路，从而抑制RA成纤维样滑膜细胞的增殖与迁移[45]。异绿原酸A抗炎活性可能与抑制NLRP3炎性复合体激活和NF-κB磷酸化表达有关[46]。绿原酸和咖啡酸可通过清除细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），抑制p38级联磷酸化和NF-κB信号通路来抑制IL-8生成，从而发挥抗炎作用[47]。莨菪亭能够通过作用于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）/环磷酸腺苷反应单元结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）通路，抑制成纤维样滑膜细胞产生IL-6，从而改善佐剂型关节炎大鼠滑膜炎症和软骨破坏[48]。本研究鉴定到的原型成分较少，在二级质谱中碎片离子响应较低，推测可能为中药水煎液成分复杂，各成分含量较低，导致吸收入血的药物浓度更低。

A-苹果酸 B-咖啡酸 C-咖啡酸甲酯 D-对羟基苯甲酸 E-异莨菪亭

课题组前期[49]采用薄层色谱法以咖啡酸为对照品，对厚藤进行定性鉴别，并采用高效液相色谱法检测了厚藤提取物中咖啡酸、异槲皮苷、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 6个成分的含量，发现咖啡酸等酚酸类成分可作为厚藤的Q-Marker。本研究基于传统功效-药理活性-活性成分的思路，运用LC-Q-TOF-MS/MS技术，从“有效性”和“可测性”[50]确定厚藤治疗AGA的Q-Marker，为进一步开展厚藤药材质量标准、体内过程及作用机制研究提供思路和基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Study on Q-Marker for treating acute gouty arthritis withbased on serum pharmacochemistry

HOU Xiao-tao1, 2, WEI Yan-ting1, 2, XIA Zhong-shang2, 3, WEI Wei2, HAO Er-wei2, DU Zheng-cai2, ZHOU Yue-min1, DENG Jia-gang2

1. Faculty of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 3. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To study the therapeutic effect ofextract on acute gouty arthritis (AGA) rats and analyze the transitional components in blood of normal rats and AGA rats based on theory of quality marker (Q-Marker) of traditional Chinese medicine, and provide experimental basis for the determination of Q-Marker.AGA model was induced by sodium urate. The effect ofextract on joint swelling index, foot pad swelling and synovial tissue pathological changes in AGA rats were evaluated. The effect ofextract on interleukin-1β (IL-1β), macrophage inflammatory protein-1α (MIP-1α), and MIP-2 levels in serum of AGA rats were observed. LC-Q-TOF-MS/MS was used to qualitatively analyzeextract, and then the blood components of normal rats and AGA rats were identified after igextract.Compared with model group, joint swelling index and foot pad thickness of rats inextract group were significantly decreased (< 0.05, 0.01), IL-1β, MIP-1α, and MIP-2 levels in serum of high- and medium-doseextract groups were significantly decreased (< 0.05), infiltration of inflammatory cells in synovial tissue were reduced in high- and medium-doseextract groups. 53 components were identified fromextract, including resin glycosides, flavonoids, organic acids, coumarins, nucleosides, lignans, among which organic acids and flavonoids were the main components. Fragmentation rules of some compounds of resin glycosides, flavonoids, organic acids, and coumarins were also speculated. Four components including malic acid, caffeic acid, methyl caffeic acid and 4-hydroxybenzoic acid were identified in normal rat sample plasma. Four components including scopoletin, caffeic acid, methyl caffeic acid, and 4-hydroxybenzoic acid were identified in AGA rat sample plasma.extract can significantly relieve joint swelling of AGA rats, inhibit IL-1β, MIP-1α, and MIP-2 levels in serum, and inhibit inflammatory response. Main chemical components fromextract were rapidly identified as organic acids and flavonoids by using LC-Q-TOF-MS/MS. Scopoletin, caffeic acid, chlorogenic acid and its isomers (neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C) and protocatechuic acid were injected into the blood in form of prototype components or their metabolites in AGA rats, which could be used as Q-Marker for the treatment of AGA withextract.

(Linn.) Sweet; acute gouty arthritis; quality marker; LC-Q-TOF-MS/MS; scopoletin; caffeic acid; chlorogenic acid; neochlorogenic acid; cryptochlorogenic acid; isochlorogenic acid B; isochlorogenic acid A; isochlorogenic acid C; protocatechuic acid

R285.5；R285.61

A

0253 - 2670(2021)09 - 2638 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.015

2021-04-10

广西中药药效研究重点实验室运行补助项目（20-065-38）；广西一流学科建设项目重点课题（2018XK043）；广西中医药大学校级一般硕士研究生科研创新项目（YCSY2020026）；广西中医药大学自治区级硕士研究生科研创新项目（YCSW2019170）；中国东盟传统药物研究国际合作联合实验室建设（二期）资助项目（桂科AD19110165）；农作物废弃物功能成分研究协同创新中心资助项目（CICAR2020）；广西中医药大学岐黄工程高层次人才团队培育项目（2018006）

侯小涛（1969—），女，博士，教授，从事中药活性成分及质量控制研究。Tel: 13878858205 E-mail: xthou@126.com

邓家刚，教授。E-mail: dengjg53@126.com

[责任编辑 李亚楠]