周瑞红，彭永东，李祥龙

(河北科技师范学院动物科技学院 河北省特色动物种质资源挖掘与创新重点实验室,河北 秦皇岛，066600)

赤狐毛皮经济价值较高，能给养狐业带来巨大经济效益。然而，作为被保护的动物之一，赤狐数量在不断减少，其产仔数少是造成这种现象的主要原因之一，且狐狸的产仔数遗传力低，采用常规育种方法很难在短时间内取得较大进展。另外，赤狐是季节性发情动物，在每年的12月至2月发情。雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)是哺乳动物雌激素受体的两种亚型之一[1,2]。ESR1基因是一种核酸受体，具有转录调控蛋白质的功能，参与雌性动物性腺基因的表达与调控，且能影响胚胎发育和系统进化，最终能够影响动物的繁殖表现[3,4]。目前已有研究发现，ESR1基因不仅可以调节性腺生长和分化，且能在机体能量代谢方面发挥重要作用[5,6]，可以影响动物的繁殖性能。自雌激素受体的氨基酸序列公布后，对ESR1基因的研究也取得了较大进展[7]。王宵燕等[8]利用ESR1基因上的PvuⅡ酶切位点作为苏姜猪繁殖相关性状遗传标记可以提高产仔数。有试验结果表明，绵羊ESR1基因主要位于细胞核中，并且参与机体的转录调控机制[9]，也有试验以大白母猪进行分析，表明B基因较A基因而言是优势基因，可以应用于优化繁殖性能[10]。综合分析表明，ESR1基因对动物育种具有一定应用前景。因此，对ESR1基因启动子区进行研究以便为今后的育种工作提供理论依据。

近年来，ESR1基因在家畜繁殖性能的研究和利用方面已经成为热点，前人的研究为其生物信息学分析提供了有价值的理论依据和研究意义。但国内ESR1基因的研究集中在猪和绵羊，未见狐狸ESR1基因相关研究。为此，笔者利用PCR技术扩增ESR1基因启动子区序列，并将其构建至双荧光素酶报告基因载体，通过在线软件对预测结果进行深入分析，以期扩充已有数据库，为探究ESR1基因启动子区的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验所用赤狐来自河北省昌黎县金岛育种场，取肌肉组织-20 ℃保存，用于DNA提取。

试验用到的pMDTM18-T Vector Cloning Kit，T4-DNA Ligase，限制性内切酶MluⅠ和XhoⅠ以及DNA Marker购自Takara宝生物工程有限公司；DH5α感受态细胞购于博迈德生物技术有限公司；2×Es Taq MasterMix(Dye)购于康为世纪生物有限公司；DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司(美国)；质粒DNA小量提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。引物合成和测序由北京六合华大基因公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1引物设计与合成由于基因的启动子区域通常在转录起始位点上游1.0～2.0 kb，故本次研究选取转录起始位点上游约1.8 kb为候选启动子区。参考NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中GenBank数据库公布的赤狐ESR1基因序列(登录号：XM_025998015.1)，以5’ UTR上游序列约1 800 bp及转录起始位点下游78 bp为模板，利用Primer Primer 5.0软件设计引物，利用DNASTAR7.1软件进行限制性内切酶位点分析，上游引物和下游引物分别引入MluⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点及其对应的保护碱基。上游引物为：5’-CGACGCGTGCTGTTCATAGTCCAGGGTT-3’，下游引物为：5’- CCCTCGAGGCTCGCATGTGCGTGTAG-3’。引物由北京六合华大基因有限公司完成。

1.2.2赤狐ESR1基因转录调控区生物信息学分析利用在线预测软件Neural Network Promoter Predition，Promoter 2.0，TSSW和TSSG预测启动子区；通过在线预测软件MethPrimer预测CpG岛；通过在线预测软件Nsite，AliBaba 2.1，Cister和JASPAR数据库预测核心启动子区的转录因子结合位点。在线预测软件网址见表1。

表1 分子生物学及数据分析软件

1.2.3赤狐ESR1基因启动子区PCR扩增以赤狐基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为40 μL：20 μL PrimeSTAR Max DNA Premix(2×)，14 μL ddH2O，2 μL DNA模板，上下游引物各2 μL(引物浓度10 μmol/L)。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；经94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃终延伸10 min，12 ℃保存。PCR产物用质量浓度为15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4赤狐ESR1基因候选启动子区双荧光素酶报告基因载体的构建将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并使用回收试剂盒回收目的片段，回收得到的扩增片段连接至pMDTM18-T载体；提质粒后连同双荧光素酶载体pGL3-Basic一起分别用限制性内切酶MluⅠ和XhoⅠ进行双酶切(37 ℃, 2～3 h)，双酶切反应体系为20 μL：2 μL Green Buffer(10×), 2 μL 质粒，14 μL ddH2O,MluⅠ和XhoⅠ各1 μL 。利用T4-DNA Ligase将双酶切后的目的片段与pGL3-Basic载体16 ℃过夜连接，连接体系为20 μL：2 μL T4 DNA Ligase，2 μL T4 DNA Ligase Buffer(10×)， 2 μL 酶切后的pGL3-Basic质粒，8 μL目的片段，6 μL ddH2O。通过热激法将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；后进行涂板培养，挑取阳性单克隆菌落进行鉴定、测序，测序成功后提质粒，-20 ℃保存备用。

3 结果与分析

3.1 赤狐ESR1基因启动子区序列的扩增及载体构建

通过PCR扩增出赤狐ESR1基因启动子区约1 880 bp的片段，PCR产物经质量浓度为15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，其结果与预期片段大小一致(图1)，经pMDTM18-T中间载体后构建至表达载体pGL3-Basic上，经菌液PCR、双酶切及测序鉴定后，目的片段大小一致且序列正确，表明重组克隆载体pGL3-Basic-ESR1构建成功(图2)，该重组质粒可用于后续试验。

1：目的片段；M：D2000 DNA Marker图1 PCR电泳检测结果

1：目的片段；M：D2000 Plus DNA Marker图2 重组载体双酶切检测结果

3.2 赤狐ESR1基因启动子区序列生物信息学分析

运用在线软件对测序得到的结果进行序列分析，GC含量占49.89%，AT含量占50.11%。用在线软件Promoter 2.0预测出2个启动子临界位置，分别为-1 602 bp(得分0.583)和-502 bp(得分0.671)；TSSW程序预测启动子位置在-1 702 bp(得分1.04)；TSSG预测启动子位置在-1 548 bp(得分6.81)。在线预测软件Neural Network Promoter Predition分析发现2个核心启动子(表2)。

表2 赤狐ESR1基因启动子区Neural Network Promoter Predition程序预测结果

3.3 赤狐ESR1基因CpG岛及转录因子结合位点预测

所获得的赤狐ESR1基因启动子区存在多个转录因子作用元件，如AP-1，SRF，GATA-1，c-Jun，Oct-1，SP1，NF-1和cEBP等识别位点，其中Sp1家族结合位点、NF-1和cEBP的结合位点出现频率较高且在多个预测软件中出现。综合多个软件对转录因子结合位点预测分析，单个软件预测结果不做考虑，结果见表3。

表3 赤狐ESR1基因启动子区转录因子结合位点预测结果

一般认为，CpG岛大于100 bp，且GC含量大于50%，使用MethPrimer软件预测分析显示ESR1基因启动子区存在一个CpG岛(图3)，长度为148 bp，位于-1 749～-1 602 bp。

图3 赤狐ESR1基因CpG岛预测结果

4 结论与讨论

ESR1基因通过转录调控蛋白控制雌激素基因的转录过程进而对生殖发育等功能产生影响[11]。已经有研究证实ESR1基因在动物繁殖中发挥着重要的作用[12]，因此在今后的育种工作可以利用相关的研究成果以提高产仔数，为养狐业提供经济效益。基因表达调控中最重要的就是转录的起始，而转录调控的实质是通过上游调控序列与启动子及转录因子相互作用来调控基因的表达[13]，基因启动子活性区域研究对揭示基因功能具有重要的意义[14]。然而，赤狐ESR1基因启动子的序列结构、功能和调控机理等尚未报道。因此，本次研究对赤狐ESR1基因启动子区的序列与结构进行生物信息学分析，有助于阐明其功能及转录调控机制，为进一步揭示赤狐ESR1基因作用机理和转录调控网络鉴定提供参考依据。

本次研究成功克隆了ESR1基因启动区序列，并将其成功构建至双荧光素酶报告基因载体。有研究发现，若克隆片段中只含转录起始位点上游区域可能会导致实验结果的假阴性，而克隆片段中包含转录起始位点、ATG或部分CDS区序列会很大的提高实验结果的阳性率[15]。故本次研究克隆的片段中包含转录起始位点下游78 bp序列，符合上述要求，实验扩增出的ESR1基因启动子区序列与预测基本一致。基因表达是靠转录因子来进行调控的，不同的转录因子有不同的转录调控元件，靠与特定的启动子区域结合而改变mRNA的转录水平[13]。Sp1是哺乳动物基因转录活化的必需因子，可通过识别基因启动子上富含GC序列的位点发挥作用，其结合位点在转录激活的结构域中分布非常广泛，且在哺乳动物大量的基因表达和细胞生物学的调控进程中发挥作用[16～19]。研究已证明，Sp1对于小鼠胚胎发育表达的第一个基因HSP70.1的转录来说是必需的[20]；除此之外，在基因的表达调控中，Sp1具有协同激活转录的功能，即转录水平在有两个Sp1转录结合位点存在时会大大提高[21]。NF-1转录因子是重要的转录因子之一，通过与CAAT box结合从而影响基因的表达，目前已有研究表明，在NF-1与以RNA聚合酶Ⅱ为转录起始复合物的形成有紧密联系[22]，这说明NF-1可能在ESR1基因的表达中发挥作用。

本次研究运用多个生物信息学软件对赤狐雌激素受体ESR1基因候选启动子区域和转录因子结合位点进行预测分析，增加了预测结果的可靠性，为后续的ESR1基因的研究奠定理论基础，后续还需要对启动子核心区域及转录因子的调控作用等进行瞬时转染(Transient Transfection)试验验证，对转录因子结合位点还可进行染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)技术、凝胶阻滞分析(Electrophretic Mobility Shift Assay, EMSA)试验和DNA足纹分析(DNase footprinting)等验证其具体作用及功能。