吴 浩，周 磊，袁莉霞，孙崇鲁

（浙江医药高等专科学校，浙江 宁波315100）

三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum）又称金钱吊葫芦，是葡萄科崖爬藤属珍稀药用植物，全株可入药，以块根效果最佳。主要分布于浙江、福建等省，可用于治疗风湿性关节炎、肝炎及病毒性脑膜炎等多种疾病［1］。由于临床应用量的激增，野生蕴藏量急剧下降，近年来栽培［2，3］、组培［4］等方面的研究集中。由于三叶崖爬藤与爬藤属其他植物外形颇为相似［5］，因此在三叶崖爬藤种质资源收集过程中会遇到一定的困难。

近年来分子鉴定技术已广泛应用于植物物种的鉴定，其中DNA条形码序列分析已逐渐被应用于多基原鉴定、产地鉴别等方面。用于鉴定的DNA条形码有ITS、matK和psbA-trnH等，谭新宁等［6］利用ITS序列成功鉴定了青葙子（Celios cristata）及其6种同属的混伪品；Zhou等［7］利用ITS序列成功鉴定25种雪藤属草药，并建立了该类草药的分子标记系统；Zahra等［8］对32种唇形科植物利用rbcL、matK以及psbA-trnh进行鉴定，结果发现matK和psbA-trnh两种序列对种间的鉴定成功率高于rbcL，为40%；郑辉等［9］研究峨眉山区唇形科药用植物发现，以ITS2和matK序列鉴定唇形科药用植物是最快速、准确的鉴定和识别方法，能准确地阐明物种之间的亲缘关系。

matK是位于叶绿体等基因组中tmK基因的内含子部分［10］，用于编码的matK基因分子量小，拷贝数多，结构简单，不仅含有较高的基因同源性，而且还存在大量的变异位点，可用于物种间亲缘关系研究及进化树构建，是鉴定同属不同植物品种的优良候选基因［11-13］，因此在各类药材鉴定中具有较好的应用前景。本研究从生物信息学的角度对三叶崖爬藤的matK基因进行分析，为三叶崖爬藤资源开发提供数据支持，为濒危药用植物三叶崖爬藤的分子鉴定及保护提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

除三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum）通过转录组测序获得外，其他13种matK基因序列均从NCBI网站上下载得到，用于研究系统进化树，所下载其他崖爬藤属植物的matK基因序列Genbank号如表1所示。

表1 物种名及Genbank号

1.2 数据分析

利用NCBI ORFfinder对三叶崖爬藤matK基因进行分析，搜索开放阅读框；采用ProtParam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析三叶崖爬藤matK蛋白的氨基酸种类及相对分子质量等理化性质；利 用Protscale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl？1）进行matK亲/疏水性的预测；利用在线软件SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）预 测matK的 信 号 肽；运 用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）完成跨膜结构域的分析；利用软件Tar⁃getP 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.php）进行亚细胞定位预测；利用在线工具JPred 4（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/）预测二级 结构，再利用SWISS-MODEL（http：//www.swissmodel.expasy.org/）进行同源建模，预测三维结构；最后运用MEGA7对三叶崖爬藤等14种matK基因序列完成进化树的构建。

2 结果与分析

2.1 开放阅读框预测

三叶崖爬藤matK基因的开放阅读框分析见图1。三叶崖爬藤matK基因序列长度为969 bp，利用ORFFinder对其进行开放阅读框分析，共获得6个开放阅读框（ORF1～ORF6），其中ORF1的长度最大，为969 bp，起始密码子位于171 bp，终止密码子位于969 bp，共编码266个氨基酸。

2.2 氨基酸组成分析

ProtParam分析表明，三叶崖爬藤matK的分子式为C1508H2222N378O371S7，相对分子质量为4 486，共含有20种氨基酸（图2），其中亮氨酸的比例最高，占所有氨基酸的12.40%，其后依次为苯丙氨酸（10.50%）、丝氨酸（10.20%）、异亮氨酸（7.50%）、赖氨酸（6.40%）、天冬酰胺（6.00%）、络氨酸（6.00%）、组 氨 酸（5.60%）、缬 氨 酸（4.90%）、谷 氨 酰 胺（4.90%）、精氨酸（3.80%）、甘氨酸（3.80%）、脯氨酸（3.80%）、丙氨酸（3.00%）、谷氨酸（3.00%）、天冬氨酸（2.60%）、色氨酸（2.30%）、甲硫氨酸（1.90%）、半胱氨酸（0.80%）、苏氨酸（0.80%）。不稳定系数为49.32，该蛋白为不稳定蛋白。

图1 三叶崖爬藤matK基因的开放阅读框分析

图2 三叶崖爬藤matK的氨基酸组成

2.3 亲/疏水性分析

三叶崖爬藤matK中存在一些极性氨基酸，对蛋白质的高级结构形成有一定的影响，利用Protscale对三叶崖爬藤matK的氨基酸序列进行亲/疏水性分析（图3），预测结果发现总平均疏水指数（GRAVY）为-0.020，说明此蛋白为亲水性蛋白质，最高分值为2.40，最低分值在-2.05。

图3 三叶崖爬藤matK氨基酸的亲/疏水性

2.4 信号肽预测分析

利用在线软件SignalP4.1对三叶崖爬藤matK的信号肽进行预测分析（图4）。结果表明，三叶崖爬藤matK最大S值为0.899，出现在第12位氨基酸上；最大Y值为0.134，出现在第20位氨基酸上；最大C值为0.081，出现在第28位氨基酸上。S平均值大于0.5，表明该蛋白为分泌蛋白，存在信号肽，属于信号肽的概率高达99.8%，信号肽剪切位点预测处于64～65位氨基酸。

图4 三叶崖爬藤matK的信号肽预测

2.5 跨膜区预测

利用软件TMHMM Server v.2.0对三叶崖爬藤matK蛋白进行跨膜预测分析（图5）。结果表明，该蛋白膜外的比例为100%，而在膜内的比例为0，说明该蛋白不存在跨膜区，不具备介导细胞内及细胞间的信号传递功能。

图5 三叶崖爬藤matK的跨膜结构预测

2.6 亚细胞定位预测

通过软件TargetP 2.0对三叶崖爬藤matK蛋白进行亚细胞定位预测（图6）。结果表明，线粒体导肽的可能性为0，叶绿体转运肽的可能性为0.014 3，类囊体管腔转移肽的可能性为0，因此三叶崖爬藤matK蛋白只存在于叶绿体中。

2.7 蛋白二、三级结构预测

利用在线工具JPred 4分析三叶崖爬藤matK氨基酸序列的二级结构。结果如图7所示。再利用SWISS-MODEL对三叶崖爬藤matK蛋白进行同源建模，获得该蛋白质的三维结构，如图8所示。

2.8 系统进化树的构建

图6 三叶崖爬藤matK的亚细胞定位预测

图7 三叶崖爬藤matK的二级结构

图8 三叶崖爬藤matK的三维结构

通过NCBI收集13种爬藤属植物的matK基因，并与测序获得的三叶崖爬藤一起通过MEGA7构建进化树（图9）。结果显示，单叶红枝崖爬藤、红枝崖爬藤、尾叶崖爬藤、草崖藤、毛枝崖爬藤与三叶崖爬藤的亲缘性较高；显孔崖爬藤、广西崖爬藤、茎花崖爬藤、过山崖爬藤、厚叶崖爬藤、景洪崖爬藤、十字崖爬藤与三叶崖爬藤的亲缘性略远；其中崖爬藤的亲缘性最远。

图9 三叶崖爬藤matK基因的系统进化树

3 讨论

目前matK蛋白大多处于功能及表达方面的研［14，15］，本研究所编码的三叶崖爬藤matK蛋白质预测位于细胞器叶绿体中，所含的氨基酸包括20种，基因解析中发现翻译的蛋白含有相对较多的极性氨基酸，该蛋白不稳定系数为49.32，表明为不稳定的亲水蛋白质，含有信号肽，不含跨膜区。此研究为三叶崖爬藤matK蛋白的提取研究提供了一定的基础。

matK基因序列结构相对保守，在同属类植物中同源性较高，较rbcl进化速率慢［16］，快于ITS［17］，可应用于下一级（种）的分类。近年来，matK被应用于多种植物的亲缘性研究，陈芙蓉等［18］通过matK、trnL等序列的分析，建立一种能快速鉴别野菊以及药用菊的有效方法；黄琼林等［19］通过构建matK基因的系统进化树，直观有效地将高良姜和混伪品区分开来；戚华沙等［20］通过trnH-psbA、matK序列对不同来源的34份油茶种子完成了鉴别，发现trnH-psbA+matK序列可有效鉴别普通油茶、越南油茶以及其他供试油茶物种；刘利平等［21］利用DNA条形码的4个序列（matK、rabL、psbK-psbI、atpF-atpH）对天南星及其易混品进行鉴定，建立了适用于该物种的DNA条形码有效鉴别方法。本研究测序获得三叶崖爬藤matK基因序列，通过NCBI网站，Blast对比获得13条同属植物matK序列为969 bp，拥有6个开放阅读框；通过构建的系统进化树发现毛枝崖爬藤与三叶崖爬藤的亲缘性最高，崖爬藤与三叶崖爬藤的亲缘性最远，且三叶崖爬藤能有效地与其他爬藤属物种区分开来。本研究为后续深入研究三叶崖爬藤matK基因，并有效利用该基因进行爬藤属或下一级分类研究奠定了基础。