越安琪，罗卉卉，黄卫平，陈登权，金素钰，黄 林，郑玉才

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，成都610041；2.四川省凉山州畜牧兽医研究所，四川 西昌615400）

乳是新生后代最主要的营养源，对后代早期生长发育至关重要。有关乳的研究在牛乳和人乳上的报道很多，并涉及营养学、免疫学等广泛的研究内容［1，2］。国内对猪乳的研究报道相对较少。李卫真等［3］采用电泳方法对二花脸猪乳蛋白组分进行了分析；猪乳中常规营养成分和激素含量分析也有一些报道［4，5］；秦宜德等［6，7］、Qin等［8］对猪乳中一组高分子量蛋白进行了较深入的研究，涉及这组蛋白质的多态性、与生产性能的关联、纯化和鉴定等，但通过分离纯化和部分测序等方法，仍无法确定该蛋白的种类；张水斌等［9］还对猪乳中上皮黏蛋白的多态性进行了分析；国外对猪乳的研究较多［10-12］。

凝胶电泳上显示的猪乳蛋白质组成与牛乳有明显差异［3］，很多蛋白质难以通过图谱比较进行定性，影响了对猪乳的功能研究。考虑到猪乳研究对中国养猪业的实际意义，以及质谱方法在蛋白质研究中的重要技术支持［13］，本研究采用电泳技术分离猪乳中的蛋白质，并利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法对猪乳中几种蛋白质进行鉴定，为更好地认识猪乳的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 猪乳的采集与处理

于夏季在四川省西昌市某猪场选取健康的大白猪（Sus scrofa）8头，试验猪处于泌乳中期。在每头猪的颈部肌肉注射20 IU催产素，约10 min后分别手工挤乳于大离心管中，冰冻后用冰瓶带回实验室超低温冰箱保存。

将冰冻的猪乳解冻后混匀，以3 000 g于4℃离心15 min去除乳脂，取中间的脱脂乳分装于EP管中，于-80℃保存备用。

1.2 脱脂乳中蛋白质含量测定

猪脱脂乳用去离子水适当稀释后，用Bradford染料结合分析法测定脱脂乳中蛋白质含量［14］，以牛血清蛋白为标准品。

1.3 脱脂乳蛋白电泳

电 泳 参 照Laemmli［15］的 方 法，用MP3电 泳 槽（Bio-Rad，USA）采用12.5%的分离胶SDS-PAGE，在变性条件下分离猪脱脂乳蛋白，每孔上样4μg乳蛋白。电泳凝胶经考马斯亮蓝染色，脱色后用凝胶成像系统（Bio-Rad，USA）拍照。

1.4 脱脂乳中3种蛋白质的质谱鉴定

将凝胶上分子质量在14.4 kD～20.0 kD的3条电泳条带用干净的手术刀片切下置于EP管中，由武汉金凯瑞生物工程有限公司进行质谱鉴定。首先对凝胶中的蛋白质进行烷基化和酶解，即加入终浓度10 mmol/L的二硫苏糖醇还原蛋白质，再加入55 mmol/L碘乙酸铵烷基化，最后加入1μg胰蛋白酶过夜酶解；酶解产物用C18柱脱盐，真空干燥后用15μL上样缓冲液（0.1%甲酸，3%乙腈）溶解多肽；多肽混合物再用LC-MS/MS（eskperTMnanoLC，AB SCIEX Triple TOF 5600-plus）分离和鉴定；串联质谱获得的数据用质谱仪中的Proteinpilot软件进行分析，检索数据库为uniprot-taxonomy_Sus scrofa_190507_fas⁃ta和uniprot-taxonomy_Bos taurus_190507_fasta，设置的可信度≥95%，unique peptides≥1。

2 结果与分析

2.1 猪乳蛋白的电泳

猪脱脂乳蛋白在12.5%的SDS-PAGE上获得较好的分离（图1）。由图1可知，不同个体蛋白质组成接近，能显示15种左右的蛋白质，并在很宽的分子质量范围内分布。凝胶上可见猪乳中特有的1种高分子量蛋白（HMWP），酪蛋白比例较低，各种蛋白质组分的相对含量存在个体差异。

2.2 猪脱脂乳中3种蛋白质的质谱鉴定

对图1中分子量在14.4 kD～20.0 kD的3条蛋白质区带进行二级质谱鉴定，均获得了多种可能的蛋白质，相关鉴定信息见表1。根据比对得分并结合分子量等信息，2种蛋白质分别为β-乳球蛋白（β-LG）和乳清酸蛋白（WAP），但有1种蛋白质（样品号为B）未获得可信的鉴定结果，相关信息见表2。

图1 大白猪脱脂乳蛋白的SDS-PAGE

表1 二级质谱鉴定信息统计

表2 蛋白质质谱鉴定相关信息

3 讨论

猪乳中的蛋白质是影响其营养价值的主要组分之一。本研究表明，在SDS-PAGE凝胶上，显示的猪乳蛋白质组成明显不同于牛乳，其中酪蛋白比例相对较低。李卫真等［3］报道，二花脸猪初乳中酪蛋白占总蛋白的比重约为48%，牛乳中酪蛋白一般占80%左右。大白猪乳蛋白电泳凝胶上也显示出猪乳中特有的高分子量蛋白，尽管其种类还未得到鉴定［8］。

本试验采用液相色谱-串联质谱法定性分析了猪乳中3种低分子蛋白质，有2种蛋白质被鉴定（β-乳球蛋白和乳清酸蛋白），这对今后深入研究猪乳中蛋白质的生物学功能有重要意义。未鉴定的蛋白质在猪乳中有稳定的表达，值得今后继续研究。电泳图谱中这些蛋白质的分子量与其理论分子量存在一些差异，可能与其修饰有关。β-乳球蛋白是牛乳中主要的乳清蛋白；乳清酸蛋白仅存在于啮齿动物、骆驼、兔、猪等动物的乳中，但反刍动物和灵长动物乳中未发现该蛋白［16］。乳清酸蛋白被认为与乳腺上皮细胞增殖的调控［17］及小鼠乳的抑菌活性［18］等有关。推测猪乳中的乳清酸蛋白对其乳腺的功能及哺乳仔猪有重要作用。