徐润强 刘宇平 张海良 刘海盛 刘钰君 姚金科

【摘要】 目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）-A及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路在结直肠癌中的表达及临床意义。方法：选取2013年9月-2015年9月本院收治的结直肠癌患者80例作为观察组，同时切取患者癌旁正常肠黏膜组织作为对照组。分別采用免疫组化法检测癌组织和癌旁组织VEGF-A、PI3K及AKT表达水平，统计比较两组三指标表达阳性率。单因素分析结直肠癌组织中VEGF-A、PI3K及AKT表达水平与患者临床病理资料的相关性，同时Spearman相关性分析VEGF-A与PI3K及AKT表达相关性。术后随访5年，比较VEGF-A、PI3K及AKT阳性和阴性表达患者生存率。结果：观察组VEGF-A、PI3K及AKT表达阳性率均明显高于对照组（P<0.05）。结直肠癌VEGF-A、PI3K及AKT阳性表达患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;结直肠癌VEGF-A、PI3K及AKT阳性表达患者TNM分期、分化程度、淋巴结转移及浸润深度比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结直肠癌组织中VEGF-A表达与PI3K、AKT表达均呈明显正相关（rs=0.625、0.517，P=0.001）。结直肠癌中VEGF-A、PI3K及AKT阳性表达患者5年生存率均明显低于阴性表达患者（P<0.05）。结论：结直肠癌组织中VEGF-A、PI3K及AKT均存在高表达现象，与肿瘤分期、淋巴结转移、分化及浸润深度呈明显相关性，且患者生存期更短，可能参与结直肠癌病情发生发展，对临床诊断及治疗具有重要意义。

【关键词】 VEGF-A PI3K/AKT通路 结直肠癌 表达 临床意义

[Abstract] Objective： To study the expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor （VEGF） -A and phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K） /protein kinase B （AKT） pathway in colorectal cancer. Method： From September 2013 to September 2015， 80 patients with colorectal cancer were selected as the observation group， at the same time the normal intestinal mucosal tissue was cut off as the control group. The VEGF-A， PI3K and AKT expression levels of cancer tissues and adjacent tissues were detected by immunohistochemistry， the positive expression rate of three indexes in two groups were counted and compared. Univariate analysis of the correlation between VEGF-A， PI3K and AKT expression in colorectal cancer and clinicopathological data， the correlation of VEGF-A with PI3K and Akt expression was by Spearman correlation analysis. The patients were followed up for 5 years， the survival rate of VEGF-A， PI3K and AKT positive and negative expression patients were compared. Result： The positive rate of VEGF-A， PI3K and AKT expression in the observation group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）. There were no significant differences in sex， age， tumor diameter and tumor site of colorectal cancer VEGF-A， PI3K and AKT positive expression patients （P>0.05）; there were significant differences in stage， differentiation degree， lymph node metastasis and invasion depth of colorectal cancer VEGF-A， PI3K and positive expression patients （P>0.05）. There were significant positive correlation between VEGF-A expression and PI3K， AKT expression in colorectal cancer （rs=0.625， 0.517， P=0.001）. The survival rate of colorectal cancer VEGF-A and PI3K and AKT positive expression patients were significantly lower than those of negative expression patients （P<0.05）. Conclusion： VEGF-A， PI3K and AKT in colorectal cancer tissues are highly expressed， and shows significant correlation with tumor stage， lymph node metastasis， differentiation and depth of invasion， it also reduces survival， may be involved in the development of colorectal cancer， it is of great significance for clinical diagnosis and treatment.

[Key words] VEGF-A PI3K/AKT pathway Colorectal cancer Expression Clinical significance

First-authors address： Zengcheng District Peoples Hospital of Guangzhou City， Guangzhou 511300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.03.001

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，是指大肠上皮内起源的肿瘤，其发病病因尚未明确定论，可能与大肠息肉、炎性疾病、生活饮食及遗传等诸多因素有关，在我国具有较高的发病率和致死率，分别高居所有恶性肿瘤的第3位和第5位，且发病率有逐年升高趋势[1]。结直肠癌早期常无特异性症状，随着病情进展可出现排便习惯改变、腹泻便秘、便血及腹痛等症状，多数患者早期很难及时诊断，加之此肿瘤恶性程度较高，出现淋巴结或血行转移时间较早，造成其病死率常年居高不下。研究指出，虽目前手术、放化疗、靶向治疗等手段不断改进，结直肠癌患者五年生存率仍仅约40.0%，整体预后质量仍不满意，因此了解其发病机制以提高早期诊治效率，已成为临床医师需重点解决的目标[2]。伴随结直肠癌分子生物学机制研究深入，多种基因、酶类及信号通路在其发生发展中受到高度关注。血管内皮生长因子（VEGF）-A是一种具有高活性的功能性糖蛋白，具有诱导肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移、新血管生成及通透性增加等功能，已被证实为多种恶性肿瘤的正向调节因子[3]。研究指出，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路与细胞增殖、凋亡密切相关，其异常活化后对细胞凋亡抑制明显，而加速细胞增殖、分化及转移速度，并可促进肿瘤新血管生成，促进肿瘤转移侵袭[4]。目前VEGF-A与PI3K/AKT通路在结直肠癌中研究相对较少，而研究其对结直肠癌发生发展影响，对肿瘤早期诊断、药物治疗靶点开发及预后监测等具有重要意义。因此本研究笔者就基于此课题展开保证，旨在为临床提供指导，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年9月-2015年9月广州市增城区人民医院收治的结直肠癌根治术患者

80例为观察组。纳入标准：均符合结直肠癌相关诊断标准[5]，且经术后病理学诊断证实;均接受手术治疗且术前无放化疗、靶向治疗等治疗史。排除标准：合并严心脑血管、肝肾肺等实质性脏器组织疾病;合并胃癌、肝癌等其他类型恶性肿瘤;合并HIV等严重免疫系统疾病;临床病理资料不完整或标本欠理想。同时切取患者癌旁正常肠黏膜组织（距离肿瘤≥5 cm）作为对照组。80例患者，男45例，女35例;年龄20～87岁，平均（56.28±11.31）岁，肿瘤部位：结肠49例，直肠31例。本研究经院内伦理委员会审核批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法 免疫组化法检测：80例结直肠癌组织和癌旁正常黏膜组织4%中性缓冲甲醛固定，常规制作石蜡包埋组织，石蜡组织5 μm厚度连续切片，脱蜡至水，抗原修复自然冷却后在医用双氧水下浸泡10 min，灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水充分洗净，置于PBS中浸泡5 min，分别滴加VEGF-A（abcam编号ab1316）及PI3K（abcam编号ab140307）及AKT抗体（abcam编号ab8805），随后置于4 ℃冰箱孵育过夜，PBS漂洗后滴加免疫显色试剂（丹麦DaKO，批号20077835B），室温环境孵育20 min，PBS漂洗后滴加以DAB显色，显微镜下控色，依次苏木素复染、脱水、透明及封片，高年资病理医师于显微镜下观察结果。结果判读：采用双盲法进行读片，癌细胞出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞，未出现则为阴性细胞，采用染色程度与染色细胞比例评分之和作为阳性标准，其中染色程度：无染色（0分）、淡黄色（1分）、黄色（2分）及棕黄色（3分），阳性细胞比例：≤5.0%（0分）、6.0%～10.0%（1分）、11.0%～20.0%（2分）、21.0%～50.0%（3分）及>50.0%（4分），两项得分相乘，总得分≤2分为阴性表达、3～4分为弱阳性表达（+），6～8分为中等强度阳性表达（++），9～12分为中等强度阳性表达（+++）[6]。将中等强度以上表达定义为本研究的阳性表达病例，不表达或弱阳性定义为本研究的阴性表达病例，计算阳性率。

1.3 观察指标 比较两组标本组织中VEGF-A、PI3K及AKT表达阳性率;单因素分析结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤部位、TNM分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移等临床病理资料相关性;所有病例随访时间截止为2020年10月1日，比较结直肠癌VEGF-A、PI3K及AKT阳性和阴性表达患者5年生存率，并绘制生存曲线。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料用（x±s）表示;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。并采用单因素分析各指标相关性，相关性分析采用Spearman法，生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法比较，并绘制生存曲线。以P<0.05為差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组标本组织中VEGF-A、PI3K及AKT表达阳性率比较 VEGF-A、PI3K及AKT在观察组结直肠癌组织中大部分呈中等和强阳性表达（图1），对照组中的癌旁正常肠黏膜大部分为阴性表达或弱阳性表达，无强阳性表达。观察组VEGF-A、PI3K及AKT表达阳性率均明显高于对照组（P<0.05），见表1。

2.2 VEGF-A、PI3K及AKT表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系 结直肠癌VEGF-A、PI3K及AKT阳性表达患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;结直肠癌VEGF-A、PI3K及AKT阳性表达患者TNM分期、分化程度、淋巴结转移及浸润深度比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 VEGF-A表达与PI3K、AKT表达的相关性分析 Spearman相关性分析显示，结直肠癌组织中VEGF-A表达与PI3K、AKT表达均呈显著正相关（rs=0.625、0.517，P=0.001、0.001）。

2.4 结直肠癌中不同VEGF-A、PI3K及AKT表达情况患者5年生存率比较 术后随访5年，结直肠癌患者中，VEGF-A、PI3K及AKT阳性表达患者5年生存例数分别为21、24、23例，5年生存率分别为36.21%、38.09%、38.33%，阴性表达患者5年生存例数分别为17、14、15例，5年生存率分别为77.27%、82.35%、75.00%，结直肠癌中不同VEGF-A、PI3K及AKT阳性表达患者5年生存率均明显低于阴性表达患者（字2=9.36、7.43、6.67，P<0.05），见图2。

3 讨论

研究指出，结直肠癌发病受多种因素影响，包括不良生活饮食习惯、遗传易感性及肠道良性病变等因素，发病机制较为复杂，涉及多因素、多因子、多步骤及多阶段参与，其中癌基因激活与抑癌基因抑制其重要作用[7]。目前，结直肠癌可采用手术、放化疗及靶向治疗等措施，但其病情整体缓解率偏低，仍具有较高的疾病复发率，总体治疗有效率不足35.0%[8]，因此深入研究结直肠癌发病分子生物学机制，可对早期诊断、治疗及药物研发提供重要指导。VEGF是一种高度特异性促血管内皮生长因子，具有促进血管内皮细胞增殖、迁移及新血管生成和通透性增加等作用，基础研究证实[9]，VEGF在癌细胞对血管内皮细胞侵袭和黏附过程中发挥重要作用，包括促进癌细胞入血转移和提高癌组织血流灌注，导致癌细胞活性增强和转移侵袭，最终造成病情发展恶化。VEGF-A是属于VEGF家族成员之一，多由炎性浸润细胞和肿瘤细胞分泌，正常机体内几乎无表达，但高表达于肿瘤等血供丰富和代谢旺盛组织，属于强效促肿瘤细胞和血管生长因子[10]。VEGF-A基因位于第6号染色体6p12位置，其中VEGF-A在新血管生成量多的组织表达较高，包括胎盘、几乎所有肿瘤、炎性疾病及缺血性心脏病等。实验研究表明，VEGF-A能改变树突状细胞功能，抑制免疫系统对肿瘤细胞攻击，并可促进肿瘤新血管生成，此外还可能诱导血管内皮生长因子受体（VEGFR）-2表达，促进淋巴管形成及肿瘤细胞淋巴转移[11]。最新有研究发现，VEGF-A在肠癌中多呈现高表达，可促进肿瘤组织新血管生成和通透性增加，参与癌细胞增殖和侵袭扩散。朱凯旋等[12]研究指出，VEGF-A在结直肠癌组织中高表达，并在淋巴结转移和TNM高分期患者中表达更高，参与患者病情发展及转移侵袭。本研究结果显示，癌组织中VEGF-A表达阳性率明显高于癌旁组织，且与结直肠癌患者的TNM分期、分化程度、淋巴结转移及浸润深度密切相关，提示VEGF-A异常高表达参与结直肠癌患者病情发生进展。

PI3K/AKT信号通路是体内重要的调控通路，正常情况下参与多种细胞基本功能，包括細胞生长增殖、凋亡、代谢及转录翻译等，但该通路异常活化后可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、侵袭转移和新血管生成，参与多种癌症、糖尿病等发生发展[13]。近年来，结直肠癌患者PI3K/AKT信号通路异常活化研究较多，已被证实其具有促进癌细胞增殖、侵袭转移及肿瘤血管生成，以及抑制癌细胞凋亡和调控癌细胞增殖周期等多种功能。Waniczek等[14]研究发现，PI3K/AKT通路异常活化后AKT可磷酸化mTOR、4EBP1等分子，向癌细胞传达生存信号，并能抑制不依赖p53途径的细胞凋亡。有研究指出，肝细胞生长因子（HGF）可经PI3K/AKT通路促进VEGF表达，当PI3K/AKT通路异常活化后，导致VEGF高表达，并能经NF-κB和β-catenin表达，最终诱导结直肠癌血管形成和转移[15]。结直肠癌实验研究发现，PI3K/AKT通路异常活化可诱导细胞周期蛋白（Cyclins）和周期蛋白依赖性激酶（CDKs）高表达，抑制p27KIP1等基因表达，缩短细胞周期G1期时间，促进细胞分裂增殖，同时还能上调基质金属蛋白酶（MMP），降解肿瘤细胞外基质，增强癌细胞侵袭和转移能力，参与结直肠癌病情发生发展[16]。但也有研究指出，PI3K/AKT信号通路异常活化仅为结直肠癌发病的早期事件，早期PI3K、AKT蛋白表达即处于高水平，与病情进展和预后无明显关系[17-18]。本研究结果显示，结直肠癌组织PI3K和AKT表达阳性率明显高于癌旁组织，同时发现TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期、分化越低、淋巴结存在转移及浸润深度越深患者的PI3K和AKT表达阳性率明显更高，且术后随访5年，结直肠癌中VEGF-A、PI3K及AKT阳性表达患者5年生存率均明显低于阴性表达患者（P<0.05）。PI3K/AKT信号通路不仅参与结直肠癌发病，且对病情发生发展和预后起着重要作用[19]。且本研究结果显示，结直肠癌组织中VEGF-A表达与PI3K和AKT均呈明显正相关。VEGF-A与PI3K/AKT通路可能在结直肠癌发生发展过程中起到协同效应[20]。

综上所述，结直肠癌组织中VEGF-A、PI3K及AKT均存在高表达现象，且与肿瘤分期、淋巴结转移、分化程度及浸润深度呈现明显相关性，且患者生存期更短，三者在结直肠癌中高表达具有密切相关性，可能参与结直肠癌病情发生发展，对临床诊断及治疗具有重要意义。

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（收稿日期：2020-11-13） （本文编辑：程旭然）