周静茹，吴飞，陈学秋，黄艳，时恒枝，杜爱芳，杨怡

捻转血矛线虫拯救血红素缺陷型酵母生长表型

周静茹，吴飞，陈学秋，黄艳，时恒枝，杜爱芳，杨怡

浙江大学动物科学学院/浙江省动物预防医学重点实验室，杭州 310058

【】已有研究表明捻转血矛线虫（）属于血红素应答基因，高浓度血红素的刺激可导致该基因的转录水平上调，但其在血红素调控中的功能尚缺乏研究。研究通过同源重组技术构建血红素合成缺陷型酿酒酵母（）敲除株，通过异源表达对该敲除株进行表型拯救试验，以期验证参与细胞内血红素转运的功能。以BY4741基因组为模板，设计引物，扩增获得（SGD:S000002640）基因序列5'和3'侧翼区同源臂；同时以pYES2-CT质粒为模板设计引物，扩增获得筛选标记URA3序列；利用两次重叠PCR技术依次将测序正确的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串联成基因敲除组件，并通过醇沉法对敲除组件进行纯化。采用醋酸锂转化法将纯化的敲除组件转化至BY4741感受态细胞中, 经SD/- URA（含250 μmol·L-15-氨基乙酰丙酸（ALA））培养基筛选，并利用多对引物进行PCR鉴定，以验证敲除株的正确性。同时以含有浙江株序列（GenBank：MK371241）及其功能域缺失序列和的质粒为模板，利用特异性引物分别进行PCR扩增，通过无缝克隆将扩增得到的目的片段插入酵母pESC-LEU表达载体，经PCR鉴定以及测序验证后，采用醋酸锂转化法将正确的表达载体转化至感受态细胞中，通过SD/- URA/- LEU（含250 μmol·L-1ALA）培养基筛选以及PCR鉴定验证阳性异源表达株的正确性。通过比较敲除株及其各异源表达株在含有或不含有250 μmol·L-1ALA的SD/- URA/- LEU液体培养基中的生长情况，进一步验证敲除株的表型同时排除表达载体对表型的影响。……