杨洋，杨静静，丁闪，唐亚梅，刘勇*（.中南大学湘雅二医院检验科，长沙 400；.中南大学湘雅二医院精神卫生研究所，长沙 400）

精神分裂症（schizophrenia，SZ）是一种严重的精神疾病，临床上主要以思维、情感和行为的分裂以及精神活动与环境不协调为主要特征，发病率和致残率高，确切发病机制未明。利培酮（risperdone，RIS）是近年来临床上广泛使用的一种非典型抗精神病药物，为多巴胺D2受体和5-羟色胺2A（5-HT2A）受体双重拮抗剂，长期用药可引起血清催乳素的升高，导致骨质疏松、泌乳、女性闭经或月经紊乱等[1]。国内外SZ 动物模型研究大多使用雄鼠，而雌鼠的相关研究报道较少，可能是因为雌鼠有生理周期，体内激素和酶的水平不稳定，对外界刺激也比较敏感，行为学不如雄鼠稳定等。本研究拟以近交系C57BL/6 小鼠为研究对象，在神经发育的关键期——围产期，采用非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂地卓西平马来酸盐（MK-801）重复处理，建立不同性别的SZ 发育小鼠模型；并予以RIS 干预SZ 发育模型小鼠；初步探讨RIS 干预下不同性别SZ 发育模型小鼠的自发活动和社会交往行为变化，为进一步在细胞和分子水平上研究RIS 致血清催乳素升高的病理机制奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级，新生C57BL/6 小鼠，体质量1 ～2 g，共60 只，雌雄各半（湖南斯莱克景达实验动物有限公司），小鼠饲养于动物房中，维持室温在（24±2）℃，湿度50%～60%，采用12 h 昼夜节律7：00 ～19：00；所有实验都在8：00 ～17：00 完成。

1.2 试药

MK-801、利培酮（美国Sigma Aldrich 公司，纯度均＞98%）。冰乙酸、氢氧化钠（NaOH）（国药集团化学试剂有限公司）。

MK-801 溶于灭菌生理盐水（NS）中，配成0.06 mg·mL－1溶液，分装储存于－70℃冰箱备用。氢氧化钠溶解于双蒸水中配成1 mol·L－1的NaOH 溶液。RIS 溶解于含1 μL·mL－1冰乙酸的双蒸水中，用1 mol·L－1NaOH 溶液调节pH 至6.0，配成0.03 mg·mL－1的溶液，现用现配。所有药物和生理盐水均按照10 mL·kg－1腹腔注射。

1.3 仪器

电子天平（SF-400C 贝意克设备技术有限公司，安徽），分析天平（METTLER AE240，瑞士），pH 计（MTTLER TOLEDO De1ta320，瑞士），数码摄像机（Sony DCR-HC40E，日本），旷场实验测试系统（ENV 515，Med Associates Inca Vermont，USA），社会交往实验测试箱（自制）。

2 方法

2.1 动物分组及处理

60 只来自15 窝新生C57BL/6 小鼠，雌雄各半，按性别分为两大组，每大组又随机分为对照组、模型组（Model）和RIS 治疗组，每组10只。各组仔鼠于P7 ～11 d 每日称重一次，模型组和RIS 治疗组于P7 d 腹腔注射0.6 mg·kg－1的MK-801 腹腔注射，对照组以NS 平行处理，注射体积为10 mL·kg－1，每日8：00 ～9：00注射1 次，连续注射5 d，仔鼠于P21 d 断奶。P45 ～59 d 各组小鼠每日称重一次，RIS 治疗组于P45 d 腹腔注射0.3 mg·kg－1RIS，对照组和模型组小鼠以NS 平行处理，注射体积为10 mL·kg－1，每日1 次，连续注射15 d。P60 d 开始进行旷场实验和社会交往实验。

2.2 自发活动测试

自发活动测试是一种用来评价实验动物（主要指大鼠和小鼠）在新环境中的自发活动水平、紧张焦虑状态、刻板行为和探究行为等的实验方法。自发活动测试箱为43.2 cm×43.2 cm×30.5 cm 规格的有机玻璃敞箱，四周安装16×16×2的红外线网络跟踪监测系统。实验在暗光、安静的房间内进行。实验开始前30 min 将小鼠连同饲养笼一起转移到行为学实验室，使其适应实验环境，实验时让小鼠自由活动10 min，测试系统自动记录小鼠的活动情况和位置信息，通过数据采集和分析处理系统在电脑中模拟出小鼠在整个实验过程中的运动轨迹，从而进行相应的分析。每只小鼠实验结束后以70%乙醇清洗实验箱。

2.3 社会交往测试

社会交往测试用于评价实验动物的社交和回避社交功能，社交功能缺陷是SZ 的主要阴性症状之一。社会交往测试箱为43.2 cm×43.2 cm×30.5 cm 规格的有机玻璃敞箱。实验前各组小鼠单只分笼饲养10 d，在分笼饲养的第9 ～10日，每日将单只小鼠放入社会交往测试箱中适应10 min，第10日测试箱适应完毕后，将各组小鼠同组内两两配对，配对小鼠的体质量差控制在2 g 以内，第11日将各组配对小鼠每次两只同时放入社会交往测试箱中，每对小鼠的测试时间为10 min，用数码相机记录配对小鼠的行为并进行分析。小鼠的社会交往行为主要分为两种，即攻击性行为和非攻击性行为，攻击性行为包括与配对小鼠的撕咬、踢打、摔跤和拳击等行为，非攻击性行为包括与配对小鼠的社交性玩耍、闻嗅、理毛和尾随等行为。评价指标为非攻击性行为百分比，非攻击性行为百分比＝非攻击性行为时间/（非攻击性行为时间＋攻击性行为时间）×100%。

2.4 统计学处理

所有数据采用SPSS 19.0 统计软件进行数据处理和统计分析。旷场实验和社会交往实验数据不同性别间比较采用独立样本t检验，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差分析存在统计学意义时，进一步两两比较采用Levene 方差齐性检验，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhane’sT2检验，数据用均数±标准差（±s）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 RIS 治疗对不同性别SZ 发育模型小鼠自发活动的影响

如表1所示，与对照组比较，雄性或雌性模型组小鼠、RIS 治疗组小鼠自发活动总路程均显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，雄性或雌性RIS 治疗组小鼠自发活动总路程均显著减少（P＜0.05）。各组组内雄性小鼠与雌性比较，自发活动总路程显著增加（P＜0.05）。

表1 各组不同性别SZ 发育模型小鼠自发活动总路程的比较Tab 1 Total distance of spontaneous activities in SZ developmental model mice of different sex groups

3.2 RIS 治疗对不同性别SZ 发育模型小鼠社交功能的影响

如表2所示，与对照组比较，雄性或雌性模型组小鼠社会交往时间、非攻击性行为百分比均显著减少（P＜0.05，P＜0.01），雄性或雌性RIS 治疗组均无显著性差异（P＞0.05）；与模型组比较，雄性或雌性RIS 治疗组小鼠社会交往时间、非攻击性行为百分比均显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。各组组内雄性小鼠与雌性比较，社会交往时间无显著性差异（P＞0.05），而非攻击性行为百分比显著增加（P＜0.05）。

表2 各组不同性别SZ 发育模型小鼠社会交往功能的比较Tab 2 Social communication function of SZ developmental model mice of different sex groups

4 讨论

SZ 的病因及发病机制复杂，涉及到遗传、环境、社会和心理学等诸多因素。SZ 的临床治疗及康复效果并不理想，由于伦理学、安全性以及SZ 临床研究手段的局限性，对SZ 病因和病理机制的研究一直未取得突破性的进展。C57BL/6 小鼠是近交系小鼠，应激反应均一，实验结果精度好，可比性强，被广泛用于遗传学、免疫学和生理学等研究，因此本研究选用C57BL/6 近交系小鼠，建立高效度的啮齿类SZ 动物发育模型，研究SZ 相关的症状学、病因学及药理学机制。目前SZ 动物模型构建多以SZ 的谷氨酸功能紊乱假说为理论依据，MK-801 是一种非竞争性NMDA受体拮抗剂，其对NMDA 受体的选择性亲和力较苯环已哌啶（PCP）和氯胺酮更强，被广泛用于SZ 动物模型构建[2]。MK-801 处理啮齿类动物可以引起动物产生一些类似SZ 的行为学和神经生物学改变，包括自发活动增加、感觉门控缺陷、社交和学习记忆功能缺陷等，并且一些行为学和神经生物学改变可以被典型或非典型抗精神病药所改善[3]。RIS 是近年来临床上使用比较多的非典型抗精神病类药物，尽管其克服了典型抗精神病药物的许多不足，但由于其作用于中枢神经系统的基础神经通路，可能引起女性患者的内分泌功能失调，如血清催乳素升高导致的泌乳、骨质疏松、女性月经紊乱和闭经等不良反应[4]。虽然雌鼠有生理周期，体内激素和酶的水平波动较大，行为学不如雄鼠稳定，建立SZ 动物模型存在不足，但鉴于上述与性别相关的病理改变，有必要开展雌性和雄性SZ 动物模型的比较研究，以期为SZ 性别相关的病理学研究提供可靠的实验依据。

旷场实验是可观察自然状态下啮齿类动物在新异环境中的活动情况，主要用来评价动物的中枢兴奋状态、运动功能、探索行为、紧张度和情绪反应等[5]。实验动物在旷场实验中自发活动总路程增加表示实验动物中枢兴奋性增加。本研究中MK-801 诱导的SZ 发育模型小鼠（雄性或雌性）自发活动总路程较对照组均显著增加，表明SZ 发育模型组小鼠的中枢兴奋性增加，这与既往研究报道一致[6]。RIS 治疗组小鼠自发活动总路程较SZ 发育模型组显著减少，表明非典型抗精神病药物RIS 给药改善了SZ 发育模型小鼠的自发活动增加。研究表明MK-801 诱导的小鼠自发活动增加与NMDA 受体阻断触发的中脑边缘尤其是伏核部多巴胺的释放增加有关，然而一些单胺类递质缺乏的SZ 动物模型也表现出自发活动增加，因此MK-801 诱导的小鼠自发活动增加可能涉及大脑多个神经递质系统[7]。有研究表明，自发活动的增加与大脑谷氨酸、γ-氨基丁酸和多巴胺等递质系统的相互作用密切相关[8]。本研究各组雄性小鼠的自发活动总路程明显大于同组的雌鼠，表明不同性别小鼠的自发活动能力存在差异，雌性小鼠相对比较安静少动，而雄性小鼠多动，喜欢打斗，活动能力较强。雌鼠存在生理周期，其体内激素和酶的代谢水平不稳定，对药物的反应性也有不同，这些因素可能导致了自发活动的差异，但究竟哪种机制发挥主要作用目前仍不清楚，可能是多种途径共同作用的结果，具体原因有待进一步深入研究。

社交功能缺陷是SZ 阴性症状的主要表现之一，SZ 患者往往有多种社会功能障碍，社交功能缺陷与SZ 的异质性和疾病进展有关[9]。临床研究表明，NMDA 受体拮抗剂可以诱导啮齿类、灵长类和人类出现社交功能损害[10]，并且社交功能损害可以被一些抗精神病药物所逆转。NMDA 受体拮抗剂诱导的社交功能损害可能与前额叶皮质区的5-HT 和多巴胺递质系统功能紊乱有关，主要表现为前额叶皮质区5-HT 系统较多巴胺系统功能活动增强[11]。本研究社会交往实验中，正常对照组、SZ 发育模型组及RIS 治疗组各组小鼠的总活动时间比较无显著性差异，表明MK-801 和RIS 处理对小鼠总体活动水平无明显影响。SZ 发育模型组小鼠社会交往时间较正常对照组显著减少，RIS 治疗组小鼠社会交往时间与正常对照组比较无显著性差异，RIS 治疗组小鼠社会交往时间较SZ 发育模型组增加，表明SZ 发育模型组小鼠成年后社交行为明显减少，0.3 mg·kg－1RIS可以完全逆转MK-801 诱导的小鼠社交行为减少。各组社交行为中非攻击性行为百分比也不同，SZ发育模型组小鼠的非攻击性行为百分比显著小于正常对照组，而RIS 治疗组小鼠的非攻击性行为百分比与正常对照组接近，显著高于SZ 发育模型组，表明围产期MK-801 重复处理小鼠可致小鼠成年后社交行为中攻击性行为增加，非典型抗精神病药RIS 可以逆转MK-801 诱导的小鼠攻击性行为增加，与Wang 等[12-13]用NMDA 受体拮抗剂PCP 处理动物的结果一致。本研究中各组雄性小鼠的非攻击性行为百分比均显著低于同组雌鼠，表明雄性小鼠社会交往行为中的攻击性行为较雌性小鼠显著增加，由于雌性与雄性小鼠激素及代谢水平等的差异，雌性小鼠性情温和，通常较少发生打斗现象，而雄性小鼠通常无法和平相处，时常打斗，所以各组雄性小鼠的攻击性行为较雌鼠均显著增多。综上可见，围产期MK-801重复处理诱导的SZ 发育模型雌性小鼠与雄性模型小鼠比较，虽存在行为学的显著差异，但SZ雌性模型小鼠与雄性小鼠类似，存在明显的自发活动和社交功能损害，可部分模拟SZ 的阳性和阴性症状，作为SZ 雄性动物模型的有效补充，可用于SZ 性别相关的病理机制研究。本研究中RIS 给药一定程度逆转了MK-801 诱导的小鼠自发活动增加和社交功能损害，这可能与RIS 对D2受体、5-HT2A受体、肾上腺素α1受体等的拮抗作用有关，介导这些行为改变的神经机制复杂，有待进一步的研究探索其作用途径和过程。