杨卫红，杨鹤飞，冯 云，章域震，潘 虹，王 娟

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)引起的一种人兽共患中枢神经系统急性传染病，病死率几乎为100%，带病毒犬仍然是人类狂犬病的主要传染源[1]。我国狂犬病的大流行发生在上世纪80年代，90年代通过犬只的综合管理和人用狂犬病疫苗的应用，狂犬病得到控制，本世纪初开始新一轮的流行，近几年全国各省份均有流行，发病总体呈下降趋势[2]。云南省狂犬病的流行趋势与全国狂犬病流行基本相似，2018年全省16个州(市)中有14个合计发生狂犬病21例，仍处于大范围流行[3]。RABV核蛋白(nucleoprotein，N)基因或糖蛋白(glycoprotein，G)基因的系统进化分析表明，我国的RABV可划分为6个进化群(China-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)，各省有不同的分布[4-5]。以往研究显示，云南境内流行的RABV进化群可分为YN-A、YN-B、YN-C和YN-D，并依次属于China-Ⅰ、China-Ⅵ、China-Ⅱ和China-Ⅲ[6]，RABV的遗传多样性提示云南省RABV来源的复杂性[7-11]。本研究对近10年人间狂犬病的流行特征、2015-2018年云南省RABV样本N基因和G基因序列测定和系统进化进行分析，以阐明近期云南省狂犬病的流行和基因进化特征。

1 材料与方法

1.1资料收集 狂犬病病例资料源于中国疾病预防控制中心信息系统，运用描述流行病学方法对全省狂犬病的疫情数据进行分析；人口资料来源于云南省各州、市统计局和网络直报系统。

1.2样本 收集2015-2018年云南省各地疾控中心和动物疫控部门送检(云南省地方病防治所的病人)、病犬、可疑犬、病牛、病驴等脑组织标本，经直接免疫荧光法(Direct immunofluorescence assay，DFA)抗原检测阳性的样本，-80 ℃低温保存备用。

1.3RABV核酸检测 用QIAamp viral RNA mini kit(德国QIAGEN公司)提取病毒RNA，用Ready-To-Go You-Prime First-strand beads(Ge Healthcare,USA)反转录合成cDNA。逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-polymerase chain Reaction, RT-PCR)检测DFA阳性的组织标本中RABV核酸，扩增引物N基因(1 353 bp)为：N127(5′-ATGTAACACCTCTACAATGG-3′)和N829(5′-GCCCTGGTTCGAACATTCT-3′)；N577(5′-AAGATGTGYGCYAAYTGGAG-3′)和NR-E(5′-GGATTGACRAAGATCTTGCTCAT-3′)。G基因(1 575 bp)为：G-20F(5′-CTCAAAAGACTCAAGGAAAGATG-3′)和G966R(5′-ATGACTAAGACGTCTGAAACTCAC-3′)；G822F(5′-TCAGCTAGTAAATCTACATGACTTTC-3′)和GR-85(5′-GAGGACTGTTAAATCCAGAGATC-3′)[12]。反应体系依次加入Go Taq Green Master Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、去离子水18 μL、cDNA 5 μL，充分混匀。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4N基因和G基因片段的测序 1%琼脂糖凝胶检测扩增产物，阳性样本由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。

1.5序列分析 测序结果使用DNASTAR 软件包中的Seqman软件对测序结果进行拼接和质量分析；使用BioEdit(version 7.0.5.3)和ClustalX 1.8软件进行核苷酸和氨基酸序列的比对；使用Gene DOC软件进行核苷酸和氨基酸差异度分析；使用MEGA 5.05软件完成基于Neighbour-joining(NJ)方法的进化树绘制，Bootstrap值设定为1000。

2 结 果

2.1流行慨况 从2008-2018年，云南省共有828例狂犬病报道，全省发病率在0.046/10万～0.285/10万之间波动，年均发病率为0.164/10万。11年均有病例报告，2010年病例数达到高峰，发病数为131例，发病率为0.285/10万，往后几年病例数逐年降低，2018年报告病例数21例，发病率为0.046/10万，发病总体呈下降趋势。

2.2 流行分布

2.2.1地区分布 狂犬病在云南省广泛分布，2008-2018年全省16个州(市)中14个有该病的流行，疫情波及的县(市、区)达70多个，11年以来丽江、怒江无人间狂犬病病例报告。各地发病有明显的差异，疫情主要分布在昭通、曲靖、文山和红河，分别位于我省的滇东北、滇东和滇南地区，与相邻的四川、贵州、广西和越南毗邻。近年来，边境地区西双版纳、普洱等疫情较重。从发病地区的病例数上看，2008年仅有6个州(市)病例报告，即昭通、曲靖、文山、红河、昆明和西双版纳，2009年玉溪、临沧及2010年滇西地区的保山市相继出现病例，2011-2014年疫情扩散到滇中地区的楚雄和大理，2016年滇西北地区的迪庆首次出现该病例，狂犬病几乎分布在全省，病例有自东向西蔓延的趋势(图1)。从波及县份数与该年发病数比值来看，全省129个县，2008年总发病109例，波及20个县，波及县份数占总病例数的18.3%(20/109)；2010年波及县份数占总病例数的34.4%(45/131)；从2010年后病例数逐年下降，但是波及县份数在逐年上升，2018年波及县份数占总病例数的85.7%(18/21)，11年来占比最高，说明疫情虽有下降趋势，但疫区在相对扩大(图2)。

图1 2008-2018年云南省狂犬病疫区分布Fig.1 Rabies epidemic areas in Yunnan from 2008 to 2018

图2 2008-2018年云南省狂犬病发病数和波及县份数情况Fig.2 Rabies incidence and epidemic counties from 2008 to 2018

2.2.2季节分布 根据2008-2018年疫情资料显示，云南省全年均有狂犬病发生。11年各月总发病来看，从1月份开始就有疫情报告，8月份病例数最多有100例，2月和4月份最低均为54例，极差为46，有4个月病例数在50～60例之间，4个月病例数在60～70例，6、7、8月出现病例的高峰，分别是95例、78例和100例。从季节来看，夏秋季节高发，春冬季节发病相对温和。

2.2.3人群分布 2008-2018年男性发病数占发病总人数的72%(596/828)，女性发病数占28%(232/828)，男女发病数之比约为2.57∶1；发病年龄最大超过85岁，最小只有1岁，40～50岁年龄组发病最高，占发病总人数的22.71%，50～60岁年龄组次之，占总发病数的16.91%，从各年龄段发病构成比来看，中年、青壮年为主要发病群体，儿童次之，老年人发病相对低；从职业分布看，绝大多数患者为农民，占发病总人数的72.22%，其次为学生(中小学生为主)12.08%、儿童9.18%、工人(民工)3.99%及其它2.54%。

2.3核酸检测结果 对2015-2018年DFA狂犬病毒抗原阳性的46份样本进行RT-PCR检测，N基因检出阳性34份，G基因检出阳性33份。

2.4进化分析 使用上述2015-2018年云南34个RABV的N基因(1 353 bp)和33个G基因(1 575 bp)核苷酸序列与来自GenBank的54株RABV国内外参考株N基因核苷酸序列和40株G基因核苷酸序列构建系统进化树。图3、4显示，云南株可分为3个进化群，称为YN-A、YN-B和YN-C，YN-A属China-Ⅰ进化群，YN-B属China-Ⅵ进化群，YN-C属于China-Ⅱ进化群。此次参与研究的34个RABV N基因和33个RABV G基因均属于YN-A进化群，YN-A包含了本次调查期间所有州(市)的病毒株，并与来自四川省的6株YN-A同在一个进化支中，亲缘关系最为接近。

▲:2015-2018年狂犬病病毒云南株图3 云南省2015-2018年34株狂犬病病毒N基因序列系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of the N gene sequences of 34 rabies viruses in Yunnan from 2015 to 2018

▲:2015-2018年狂犬病病毒云南珠图4 2015-2018年33株狂犬病病毒G基因序列系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of the G gene sequences of 33 rabies viruses from 2015 to 2018

为了进一步阐明YN-A进化群病毒株间的进化关系及其与相邻省份流行株间的进化关系，单独使用YN-A病毒株与邻省同属China-Ⅰ进化群的9株RABV构建系统进化树。图3B显示，虽然2015-2018年云南省YN-A病毒株均位于进化关系较近的大分支中，但不同年份或不同地区流行株间仍存在一定差异，并可分为多个进化亚支。如2015-2018年楚雄州各县病毒株(禄丰CYN15156D、武定CYN17183D、禄丰CYN18186D、牟定CYN18188D)亲缘性较近，并与四川省2009年流行株(JX005941)流行株最为接近。2015-2017年，滇西北地区大理、保山、迪庆、怒江流行株(云龙CYN15159D、隆阳区CYN17174D、维西CYN16168D、兰坪CYN16167D)亲缘性较近。2016年和2017年昭通4支(巧家CYN16164D、巧家CYN16166D、巧家CYN16165D、巧家CYN17176D)毒株同在一个小分支上，亲缘关系比较密切。此外，楚雄州的流行株(大姚CYN16172D、姚安CYN15158D)和四川省的毒株(四川JX005943)同属一个进化亚支，而与其他云南株关系稍远。

2.5同源性分析 使用34个云南RABV N基因序列进行同源性比较，核苷酸和氨基酸同源性YN-A病毒株间分别是99.2%～100%和99.1%～100%，33个G基因序列进行同源性比较，核苷酸和氨基酸同源性YN-A病毒株间分别是98.5%～100%和98.7%～100%。

3 讨 论

云南省位于我国西南边疆，北部和东部与狂犬病高发的四川、贵州和广西省相邻，西部和南部与国外狂犬病地方性流行的缅甸、老挝和越南相连，云南省狂犬病流行受到周边地区疫情的一定影响[6，13-14]。云南省本轮狂犬病流行始于本世纪初，2010年达到高峰，随后逐年下降[6]，从地区分布来看，中部、滇东和滇南地区流行不断，2008年以来整个疫情从东向西蔓延，16个州(市)仅有2个未有病例报道，发病地区绝大多数在农村，这可能与农村地区犬只免疫覆盖率低和暴露后处置不规范等因素有关；据季节分布和人群分布结果分析认为，夏秋季节高发，春冬季节发病相对温和，这与相关研究结果一致[15]；男性患者多于女性，这可能与多数女性不太喜欢和犬只接触有关；发病以青壮年农民为主，其次是儿童和老人，农村田间户外的劳作多数为青壮年农民，增加他们暴露的机会，儿童和老人的自我防护能力差，容易被犬攻击。为进一步做好狂犬病的防控，须在农村地区开展系统全面的狂犬病预防知识宣传，鼓励给家养犬注射疫苗且拴养，提高个人防护意识，政府和有关部门应加强对犬只的管控。近年发病数虽有下降趋势，但发病县份数在增加，说明云南省狂犬病疫区广泛存在。不同地区RABV流行株存在一定差异并具有地域特征，本次研究阐明云南各地RABV的分子生物学特征，对了解该病毒的进化和传播有重要公共卫生意义。

以往研究表明，云南RABV具有多样性及传播来源较为复杂的特点[16]，并存在YN-A、YN-B、YN-C和YN-D共4个进化群[6]。本研究对2015-2018年云南省各地州(市)的34个RABV N基因和33个G基因序列的进化和同源性分析，结果表明，此次的RABV均属于YN-A进化群，说明YN-A已经发展成为云南狂犬病流行的优势进化群，并基本阐明了该进化群的地区和时间分布特点及其与相邻省份流行株的进化关系，为防控本病提供了重要的理论依据。

通过N基因和G基因进化分析表明，YN-A流行株广泛分布于云南各州(市)流行区并贯穿于整个调查区间，在2015-2018年YN-A仍是云南RABV流行的优势进化群。YN-A属于China-Ⅰ进化群，鉴于China-Ⅰ进化群为我国广大地区尤其是云南相邻省份的优势进化群[4，17]，认为该进化群病毒是通过犬类流动由相邻省份传入滇东南和滇东北地区，并逐步向滇中和滇西方向扩散，如楚雄、大理、保山、临沧、德宏、怒江和迪庆州(市)近几年的疫情及本次各地样本中检测到的病原体均为YN-A。

本次研究显示云南省2015-2018年34个N基因毒株和33个G基因毒株虽然亲缘关系非常近，但各毒株间的地域分布和特征有一定差异。2016年我省滇西北迪庆地区第1次发现RABV(维西CYN16168D)，并与怒江州2015年分离的毒株(兰坪KX096999)和2014年大理地区分离出的毒株(剑川KP202423)同在一个亚支上，表明该毒株是由于犬只的流动从大理地区传入怒江，再由怒江到迪庆。从德宏地区提取出的2015年(瑞丽CYN15160D)和2018(瑞丽CYN18187D)两株毒株与2015(梁河KT861585)毒株亲缘关系较近，提示瑞丽毒株是由境内相互传播的结果，而非由缅甸地区传进来的。各年份毒株间亦存在差异，2018年分离出的毒株间亲缘关系较之前更近，说明RABV毒株无论是相似株之间或是处于不同分支上的毒株都不断在进化。N基因序列和G基因序列的分析都可以看出，近年云南省内的RABV毒株流行基本属于境内流行。

综上所述，由于我国犬仍是目前狂犬病的主要传染源，狗群的流动轨迹几乎代表了RABV 毒株的传播动向[18]，及时掌握我省RABV的分子生物学特征对本省狂犬病的防控具有重要的指导意义。在云南省进一步加强犬只的管理(包括登记注册、疫苗注射、栓养等)和对带毒犬的合理管制扑杀对狂犬病的预防控制起决定性作用。世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)研究表明，犬群免疫率达70%以上就能高效阻断病毒的传播链，故通过使用已批准上市的狂犬病疫苗免疫犬只是消除狂犬病的重要途径[18]。为完成全球2030年消除人间狂犬疫情的防控目标，借鉴西欧消除狂犬病经验，还需落实更广泛的公众教育、预防控制狂犬病的传播、创建分散的动物控制网络和加强基于实验室的监测[4]。近年云南省农村地区狂犬病发病占主导，在狂犬病的防治中应将重点放在农村和相对边远落后地区。

利益冲突：无