王 炜，任伟宏，陈明心，蒋 露，张 岱，陈 磊

氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases, aaRS)是一类细胞内高度保守蛋白酶家族，参与到生命遗传信息翻译过程中，是确保细胞遗传信息正确翻译的酶。不同物种来源的MetRS具有结构上的多样性，适合特异性抑制剂的筛选，已被证明是理想的抗生素作用靶点[1]。在近几年的aaRS抑制剂研究中，发现的一些氨酰tRNA合成酶抑制剂，具有高选择性和强抑制能力。AN3016是一种亮氨酰tRNA合成酶抑制剂，动物实验显示，其抑制结核分枝杆菌的能力强于异烟肼[2]。

结核分枝杆菌MetRS(MycobacteriumtuberculosisMethionyl-tRNA synthetase, MtMetRS)的研究始于上个世纪，相关文献报道其氨酰化反应后就没有新的研究报道。MtMetRS研究进展缓慢的原因与其重组蛋白制备困难有关[3]。由于MetRS抑制剂存在专一性强、抗菌谱覆盖面窄的问题。为了筛选结核分枝杆菌MetRS的抑制剂，首先需要大量获得MtMetRS。我们通过构建不同重组质粒，进行重组蛋白表达筛选，最终解决了MtMetRS重组蛋白制备问题，为抑制剂的筛选提供基础条件。此外，我们使用Thermal Shift Assay(TSA)验证了重组MtMetRS与底物及其类似物的结合能力，为抑制剂的选择提供方向。

1 材料与方法

1.1材料 pET32a、pQE60、pGEX-6P-1、pTrcHisB质粒、M15大肠杆菌、BL21大肠杆菌本实验室保存。高保真DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker购自Takara公司。质粒提取、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。引物及基因合成、测序在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。青霉素、IPTG购自索莱宝公司。Milipure超滤管购自默克公司。HisPur Ni-NTA树脂、蛋白质Marker购自Thermo Scientific。ATP、Met、ADO、AMP-PNP、Sypro Orange购自Merck公司。

1.2 方 法

1.2.1MetRS序列分析 氨基酸序列决定蛋白质结构。为了分析人MetRS和结核分枝杆菌MetRS的差异，选用GenBank登录号为AAH15011.1、AAH09115.1、WP_003911321.1氨基酸序列为分析对象。……