于新祥，高召军，李 珂，齐永秀

(1山东第一医科大学·山东 济南 276000；2泰安市立医院·山东 泰安 271016)

舒脑欣滴丸由古方“芎归汤”发展而来，由川芎和当归组成，具有活血化瘀的功效，可用于治疗多种心脑血管及精神疾病[1-2]。川芎中含有较多的挥发油，当归的主要化学成分为有机酸、挥发油及皂苷，而制备的舒脑欣滴丸保留了这两种药材中有机酸及挥发油；其中阿魏酸具有抗血小板聚集、增强免疫功能的作用[3]；洋川芎内酯I及洋川芎内酯A对免疫系统及抗心血管疾病引起的炎症具调节作用[4]；当归及川芎中的共有成分藁本内酯具有改善微循环舒张血管的功效[5]。

由川芎和当归制备而成的舒脑欣滴丸，其化学成分复杂，通过某一成分对舒脑欣滴丸进行质量控制有一定的片面性。本实验采用HPLC方法建立舒脑欣滴丸指纹图谱对舒脑欣滴丸中多个成分进行归属和评价，同时进行4种成分含量测定，为舒脑欣滴丸的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 试药与试剂 阿魏酸：上海源叶生物科技有限公司，批号:H27J7L16718,纯度≥98%；洋川芎内酯I：上海源叶生物科技有限公司，批号：P02F9F54166,纯度≥98%；洋川芎内酯A：上海源叶生物科技有限公司，批号：P10J9F52613,纯度≥98%；藁本内酯：上海广锐生物科技有限公司，批号：G-010-160719,纯度≥98%；舒脑欣滴丸：天津中新药业，批号：676014，676018，677008，677019，677030；舒脑欣滴丸：解放军第88医院，批号：170121，170608，171019，180103，180523。甲醇：赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯；冰醋酸:天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯；纯净水:杭州哇哈哈集团有限公司。

1.2 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪：美国Waters公司；2998 PDA Detector紫外检测器：美国Waters公司；FR224CN电子天平：奥豪斯仪器上海有限公司；KQ-250DB数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适应性试验 色谱柱：Venuisu MP C18(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相：甲醇(A)-1.0%冰醋酸(B),梯度洗脱程序如下：0→25 min,30%→45%A;25→40 min,45%→70%A;40→45 min,70%→75%A;45→50 min,75%→75%A。柱温：30 ℃;流速：1.0 mL·min-1；进样量：10μL;检测波长：280 nm。在此色谱条件下，计算理论塔板数分别为阿魏酸4 293，洋川芎内酯I为7 553，洋川芎内酯A为12 464，藁本内酯为64 043，计算各色谱峰之间的分离度均大于1.5。将空白溶剂、混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图进行对比后，其各成分之间无相互干扰，见图1。

1.阿魏酸；2.洋川芎内酯I; 3.洋川芎内酯A; 4.藁本内酯

2.2 对照品储备溶液的配制 分别精密称取适量的阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A及藁本内酯，加入70%甲醇使其成浓度分别为100、110、150、200 mg·L-1的对照品储备液，置于4 ℃冰箱进行保存，并在使用前稀释成工作溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取5粒舒脑欣滴丸粉碎，粉碎后置于具塞锥形瓶中，加入10 mL70%的甲醇后称定重量，在100 MZ的条件下进行超声处理30 min，静置放冷，再用70%的甲醇补足失重，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜进行过滤，再取1 mL的续滤液置于10 mL容量瓶中，用70%的甲醇稀释至刻度，摇匀，所得即为供试品溶液，置于4 ℃冰箱保存。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取批号为171019舒脑欣滴丸按“2.3”项下制备同一供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下连续进样5次，记录色谱图，通过计算可得舒脑欣滴丸色谱图中各共有峰的相对保留时间RSD均<1.0%,各共有峰的相对峰面积RSD均<3.0%，即说明该方法具有良好的精密度。

2.4.2 重复性试验 取批号为171019舒脑欣滴丸的同一供试品溶液5份，在“2.1”项色谱方法下进样，记录色谱图，舒脑欣滴丸中共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.0%，表明该方法的重现性良好。

2.4.3 稳定性试验 取批号为171019舒脑欣滴丸的同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12 h按“2.1”项色谱方法下进样，记录色谱图。结果表明，各共有峰的相对保留时间的RSD均<1.0%，共有峰的相对峰面积的RSD均<3.0%，表明样品在12 h内稳定。

2.5 指纹图谱相似性评价

取10批舒脑欣滴丸样品，按照“2.3”项下方法制备10批供试品溶液，照上述色谱条件进样分析，记录色谱图，将所得数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件中，以S1为参照，对色谱峰进行多点校正，Mark峰匹配，以中位数法建立对照指纹图谱R，并进行相关分析。结果发现，10批供试品有8个特征峰，通过对照品定位指认了4个色谱峰分别为阿魏酸(1号峰)、洋川芎内酯I(2号峰)、洋川芎内酯A(4号峰)、藁本内酯(5号峰)，见图2。其中藁本内酯峰面积较大，保留时间较为居中，并且较为稳定，与相邻色谱峰的分离度良好，便于识别和评价色谱指纹图谱的特征峰，故选择藁本内酯作为参比峰。对各批次舒脑欣滴丸进行相似度评价，10批舒脑欣滴丸指纹图谱的相似度均>0.9，各特征图谱与共有特征图谱R的相似度见表1，计算各共有峰藁本内酯的保留时间和峰面积。结果见表2～表3。

表1 指纹图谱相似度结果

表2 指纹图谱共有峰的相对保留时间

表3 指纹图谱共有峰的相对峰面积

图2 10批舒脑欣滴丸相似度比较

2.6 多指标含量测定方法学考察

2.6.1 线性关系考察 分别精密量取“2.2”项下混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL,分别置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制成混合堆照品系列溶液，按“2.1”项色谱条件进样10μL,以峰面积(Y)对浓度(X,mg·L-1)进行回归分析。阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯的线性方程分别为Y=59501X-27966(R2=0.9997)、Y=49512X+11945(R2=0.9995)、Y=13216X+17612(R2=0.9996)、Y=40216X+3059.3(R2=0.9992)进样量分别在1.0～30μg、1.1～33μg、1.5～45μg、2.0～60μg内呈现良好的线性关系。

2.6.2 精密度 取“2.2”项下混合对照品溶液适量分别稀释至阿魏酸20 mg·L-1、洋川芎内酯I 22 mg·L-1、洋川芎内酯A 30 mg·L-1、藁本内酯40 mg·L-1在“2.1”项色谱条件下连续进样5次，记录色谱图。其峰面积的RSD分别为2.80%、1.29%、2.11%、2.15%；表明该方法精密度良好，符合舒脑欣滴丸4种成分含量测定要求。

2.6.3 重复性 取批号为171019舒脑欣滴丸供试品溶液5份，在“2.1”项色谱条件下进样，记录色谱图。阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯峰面积的RSD值分别为1.62%、2.67%、2.89%、2.49%；表明该含量测定方法的重复性良好。

2.6.4 稳定性 取批号为17019舒脑欣滴丸的同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12 h，按“2.1”项色谱条件下进样，记录色谱图。结果显示阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯的RSD分别在1.26%、0.73%、2.13%、1.51%；表明阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯在12 h内稳定。

2.6.5 加样回收率 取已知各成分含量的供试品溶液3 mL,共9 份，分别加入各对照品溶液适量，配成低、中、高浓度的混合溶液，每一浓度制备3 份，按“2.1”项色谱方法进样，记录色谱图。阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯平均回收率见表4。

表4 加样回收率试验结果

2.6.6 样品含量测定 分别取3个不同批次的舒脑欣滴丸按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项色谱方法进样，样品含量测定的结果如表5。

表5 舒脑欣滴丸中4种成分含量测定丸)

3 讨论

本实验首先对样品的提取溶剂进行考察，选择50%甲醇、70%甲醇、甲醇三种溶剂进行考察，结果显示，50%甲醇中阿魏酸的含量较高而洋川芎内酯A、藁本内酯含量较低；甲醇中阿魏酸的含量较低而洋川芎内酯A、藁本内酯的含量较高，选择70%甲醇可兼顾两种成分含量的最大化，故选用70%甲醇作为提取溶剂。

此次试验对流动相进行优化，通过查阅文献[6-8],对甲醇-乙酸(0.1%、0.25%、0.5%、1.0%)、甲醇-水进行考察，结果显示，采用甲醇-水时阿魏酸的出峰情况不好，加入乙酸能够改善，经试验探究采用甲醇-1.0%乙酸各成分的分离效果最好。同时本实验采用PDA检测器进行全波段的扫描，发现280 nm条件下各成分色谱峰型较好，基线平稳，无相互干扰。考察了柱温在20、25、30 ℃分离效果，结果显示在30 ℃分离效果较好。

本课题利用建立了舒脑欣滴丸指纹图谱的测定方法，同时测定了舒脑欣滴丸中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯的含量，方法灵敏简单易行，重复性好，为舒脑欣滴丸的质量控制提供了参考依据。