孙 妍，王 静，侯 喆，武天元，王伟明

(1黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036;2黑龙江中医药大学·黑龙江 哈尔滨 150040)

1 材料

1.1 实验动物 100只BALB/c小鼠，SPF级，体质量18～22 g，雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2012-0001。

1.2 菌株 肺炎支原体国际标准株(ATCCFH15531)：美国菌株保藏中心。

1.3 药物及试剂 麦冬饮片：河北安国振宇药业有限公司，批号：130109，经鉴定麦冬为四川麦冬Radix Ophiopogonis(Thunb.)Ker-Gawl.的干燥块根；阿奇霉素分散片(哈药集团制药六厂，批号：30130502)；养阴清肺糖浆：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：3150021。TRIzol试剂：美国Invitrogen；One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit：TaKaRa 公司；MUC5ac引物、β-actin引物：哈尔滨博仕生物技术有限公司；小鼠黏蛋白5ac(MUC5ac)检测试剂盒：USCN Life Science Inc.；PPLO培养基：Becton，Dickinson and Company，USA。试药均在给药前研磨成粉，溶解，涡旋混匀。

1.4 主要仪器 DL-CJ-1W生物净化工作台：北京东连哈尔仪器制造有限公司；MDF-382E-80 ℃低温冰箱：日本三洋公司；Milli-Q Reference system自动双重纯水蒸馏器：MILLI-Q公司；SorvaⅡ ST16低温离心机：Thermo公司；2、20、200μL微量加样器：Eppendoff公司；9600荧光定量PCR仪：杭州博日有限公司；Infinite M200 Pro酶标仪：Tecan公司。

2 方法

2.1 肺炎支原体培养 将MP菌株按1∶9加入到PPLO完全培养基中，置37 ℃生化培养箱进行培养，每天观察颜色变化，培养液由红色变为黄色并澄清透明时即为支原体生长。将处于对数生长期的MP进行CCU定量，常规冻存备用。

2.2 动物分组 100只BALB/c小鼠，随机分为10组，每组10只。分别为正常对照组，模型对照组，阿奇霉素组，养阴清肺组，麦冬多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组和麦冬皂苷高剂量组、中剂量组、低剂量组。

2.3 造模、给药及标本采集 除正常对照组外，其余各组用乙醚麻醉，然后用无菌注射器吸取106CCU/mLMP，滴鼻复制MP感染模型，20μL，连续感染3 d；之后各组小鼠开始灌胃给药，正常组和模型组灌胃等容积生理盐水，阿奇霉素组给药5 d(第1天给65 mg/kg，第2～5天给32.5 mg/kg)、养阴清肺组(5 mL/kg)、麦冬多糖高剂量组(81.2 mg/kg)、麦冬多糖中剂量组(40.6 mg/kg)、麦冬多糖低剂量组(20.3 mg/kg)、麦冬皂苷高剂量组(66.8 mg/kg)、麦冬皂苷中剂量组(33.4 mg/kg)、麦冬皂苷低剂量组(16.7 mg/kg)，连续给药6 d。颈椎脱臼处死小鼠，肺门处结扎右主支气管后向左侧肺内注入生理盐水1mL，反复抽洗2次，合并灌洗液，3 000r/min，4 ℃离心10 min，收取上清液，-80 ℃冻存备用；剪取右肺组织中叶，-80 ℃保存备用。

2.4 观察指标及测定

2.4.1 Real-time PCR方法检测MUC5ac mRNA的表达 取100 mg组织置于离心管中，加入适量去离子水，用匀浆机打匀，加入1 mLtrizol(预冷)提取RNA；以DEPC H2O做空白调零，混匀样品在260、280 nm波长下读数，OD260/OD280的比值用于估算核酸纯度，计算总RNA浓度，调整样品体积。以β肌动蛋白(β-actin)为内参照，MUC5AC正向引物：5′-ACCACTTTCTCCTTCTCCACAC-3′，反向引物：5′-AACAGGGCTCTTCACAGACAATA-3′；β-actin 正向引物：5′-GACGGCCAGGTCATCACTATTG-3′，反向引物：5′-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC-3′。PCR扩增仪进行循环扩增：42 ℃ 5 min,95 ℃ 10 sec,1 cycle；95 ℃ 5 sec,60 ℃ 20 sec,40 cycle；95 ℃0 sec,65 ℃15 sec,95 ℃ 0 sec。采用比较阈值法分析基因表达的量，直接得到各组小鼠肺组织MUC5ac mRNA对空白组相对表达的量。采用2-ΔΔCt公式，相对定量的方法进行计算，得出的相对表达量。

2.4.2 ELISA检测BALF中MUC5ac蛋白的含量 按试剂盒说明书操作。

3 结果

3.1 麦冬有效部位对MP感染小鼠肺组织MUC5ac蛋白表达的影响 见表1。

表1 各组小鼠肺组织MUC5AC mRNA 表的比较

3.2 麦冬有效部位对MP感染小鼠BALF中 MUC5ac蛋白含量的影响 见表2。

表2 各组小鼠 BALF中 MUC5ac蛋白含量比较

4 讨论

正常情况下，气道黏膜腺体和杯状细胞为保持呼吸道黏膜的湿润时只分泌少量黏液，当某些病因刺激呼吸道时，气道黏液分泌量明显增多，并通过咳嗽和纤毛运动将其排出，但持续的黏液分泌增多可导致气道阻滞、气流不畅、肺功能进行性降低。气道中的黏液是由不同分泌物混合而成，黏蛋白(muc)是气道黏液中的重要组成部分，其数量和性质决定气道黏液的黏度。在已有的21 种黏蛋白中，杯状细胞分泌的MUC5ac为气道中主要的分泌性黏蛋白，MUC5ac的过度表达是气道黏液分泌量及黏液黏度增加的主要原因[6]。

肺炎支原体肺炎是由肺炎支原体引起的呼吸道和肺部急性炎症。2-3d后出现明显呼吸道症状，阵发性刺激性咳嗽为突出表现，咳少量黏液或黏液脓性痰。由肺炎支原体还可引起支气管扩张[7]，并与支气管哮喘[8]有较强的关联性。

本实验在对肺组织中MUC5ac基因表达情况及BALF中MUC5ac含量进行检测时，结果显示，小鼠在正常情况下MUC5ac表达量极少，MP小鼠模型组与正常组相比MUC5ac表达含量明显上升，提示MPP可致肺部MUC5ac生成增加，气道黏液分泌量增多。麦冬多糖组与麦冬皂苷组可明显降低MP所致小鼠肺组织MUC5ac的表达，提示麦冬有效部位可通过调节MUC5ac的表达，减少肺组织黏蛋白的分泌，降低气道黏液分泌量及黏液的粘度，起到祛痰止咳作用。但麦冬有效部位的剂量与MUC5ac的表达没有明确的量效关系，需通过后续实验进行阐明。