张彦聪 窦林波 张风河

参与牙胚发育的细胞因子数量非常多，其中以BMP家族，FGF家族与牙胚发育的关系最为密切[1-2]。研究表明，PAX9是牙间充质早期标志物[3-4],并受上皮BMP4和FGF8(fibroblast growth factor,成纤维细胞生长因子)信号的调控, FGF8与BMP4互相拮抗定点了口腔外胚层上皮的成牙位点，并具有时空依赖性，表达FGF8但不表达BMP4的区域表达PAX9。在牙胚发育的前期，口腔上皮首先表达FGF8，成为牙胚将要发生的标志[5]。同时，FGF8刺激间充质在蕾状期表达PAX9，而BMP4抑制PAX9的表达，因此，来自上皮的FGF8与BMP4信号互相拮抗，共同决定了间充质表达PAX9的区域，从而确定了未来牙发生的位点[6]。反过来，间充质内被诱导产生的转录因子也反馈调节上皮内的信号。最典型的是BMP4循环反馈。在鼠胚胎E 11.5 d，牙胚上皮蕾状期，BMP4表达由上皮转移至间充质，成牙潜能也由上皮转移至间充质。上皮和间充质分泌的BMP4均能激活上皮和间充质的WNT通路和BMP通路，使信号循环反馈，不断放大[7]。可见BMP4在牙胚发育过程中起到核心作用，BMP4在合适的时间表达增强或减弱，进而影响其它信号的变化最终决定了上皮向牙胚发育。因此在微环境材料中引入BMP4多肽可激活BMP-WNT 反馈循环，从而启动牙上皮分化。

纳米纤维与细胞外基质的纤维环境相似，由于其高表面积和体积比，合成或天然生物聚合物纳米纤维已被应用于支持多能干细胞的长期培养。这种纳米结构有可能准确地模拟自然的细胞外基质，并为干细胞的附着和增殖提供亚细胞尺度上的最佳空间[8-10]。合成聚合物,如PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)、PCL、PHA具有良好的机械、生物降解性和稳定体内,容易加工和修饰[11-13]。

本课题拟使用PLGA作为基底材料，通过静电纺丝技术构建纳米纤维支架材料，结合不同时间点BMP4的干预，将鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mES cells)向牙上皮细胞诱导，为全牙再生的研究提供一定的研究思路和实验基础。

1 材料与方法

1.1 纳米纤维的制备

35%的PLGA (v/v)溶于55%N, N -二甲基甲酰胺另加10%乙醇，置于静电纺丝机的针形注射器内，在12 kV电压，调节参数，制备取向及非取向纳米纤维。将纳米纤维剪成六孔板孔径大小备用。扫描电镜表征纳米纤维形貌，接触角检测纳米纤维亲水性。

1.2 鼠胚胎干细胞培养

将冻存的鼠胚胎干细胞自液氮灌中取出，立即放入37 ℃水槽中并快速摇晃进行解冻至米粒大小冰球，快速移入15 mL离心管，逐滴加入5 mL DMEM(基础培养基)，离心(1 200 r， 5 min)，去上清。加入1 mL诱导培养基(Ko-DMEM+15%FBS+1% penicillin/streptomycin+ 1% l-glutamic acid+1 000 U/mL leukemia inhibitory factor (LIF)+1% 2-mercaptoethanol+1%非必需氨基酸)，轻轻吹打。然后移入事先铺过明胶并加有1 mL培养基的六孔板内，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入孔板中。轻轻摇匀，放入37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，次日换液。倒置相差显微镜观察细胞形貌。

1.3 鼠胚胎干细胞向口腔上皮诱导培养

将事先准备好的置入纳米纤维的六孔板用75%酒精浸泡消毒30 min后，于超净台中晾干10 min，用前在生物安全柜内紫外消毒30 min，之后F12溶液冲洗3 次后开始细胞培养。0.05%胰酶-EDTA将mES细胞消化，诱导培养基重悬，吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105mL，接种于6 孔培养板，每孔2 mL，并在不同的时间加入LDN193189(简称LDN)和BMP4，培养14 d。诱导方案分为4 组：(第1 组)对照组，普通六孔板铺明胶，加诱导培养基；(第2 组)支架材料+诱导培养基+LDN(第2～4 天)即在48 h加入LDN，持续作用48 h；(第3 组)支架材料+诱导培养基+LDN(第2～4 天)+BMP4(第2～4 天)，即48 h加LND，持续作用48 h后，加入BMP4，继续作用48 h；(第4 组)支架材料+诱导培养基+LDN(第2～4 天)+持续加BMP4(第2 天)，即48 h加LND，持续作用48 h后，加入BMP4直到培养结束。 24 h后扫描电镜观察细胞贴壁情况。 14 d取各组样本免疫荧光检测成牙相关蛋白PAX9、PITX2表达。

1.4 鼠胚胎干细胞向牙上皮诱导培养

48 h后，向培养基内加入30 pmol的BMP4，诱导方案分为4 组： (1)空白对照组：明胶表面+诱导培养基；(2)材料对照组：诱导培养基+LDN(第2～4 天) +BMP4(第2～4 天)；(3)取向支架材料+诱导培养基+LDN(第2～4 天)+BMP4(第2～4 天)； (4)非取向支架材料+诱导培养基+LDN(第2～4 天) +BMP4(第2～4 天)。以上方案均诱导14 d。免疫荧光检测成釉细胞特异性蛋白AMBN表达。

2 结 果

2.1 纳米纤维形貌及鼠胚胎干细胞形貌

纳米纤维材料成白色薄膜状，扫描电镜下显示纳米纤维分为非取向性(图 1A)平均接触角约53.5度和取向性(图 1B),平均接触角约56.6°。鼠胚胎干细胞复苏2 h后贴壁，细胞呈集落生长，第2 天开始集落趋于紧密，边缘清晰明亮、镜下观察稍稍隆起，细胞小且排列紧密，细胞间没有明显的界限， 细胞核大，可见多个核仁(图 2A)。 3 d后集落互相融合达到 60%以上，5 d可传代(图 2B)。

2.2 胚胎干细胞向牙上皮分化

A： 非取向； B： 取向

图 2 培养中的mES细胞(倒置显微镜, ×100)

2.2.1 鼠胚胎干细胞向口腔外胚层分化 以每孔1×105个细胞接种于培养板， 1 d后支架材料组全部贴壁，扫描电镜下细胞成团状生长。第2 天有大量细胞呈放射状从细胞团内爬出。第3 天有大量上皮样细胞爬出。此后上皮样细胞不断增多(图 3)。

2.2.2 外胚层相关基因的表达 诱导7 d后，PCR检测干性基因及外胚层相关基因的表达水平，发现Oct4表达下降，细胞干性水平逐渐降低，表皮特异性基因K14在第3 天表达上调， 早期外胚层特异性基因K18表达在第3 天相对较低，第5 天表达上调。在第3天FGF8表达上调，并伴随着BMP4高表达(图 4)。

2.2.3 抑制BMP4的功能可诱导mES细胞向口腔外胚层分化 在第3 天向培养基内加入BMP4的抑制剂LDN193189(LDN)，分别抑制不同的时长(24、 48 h)，免疫荧光检测口腔外胚层上皮特异性基因Pitx2的表达情况, 48 h组可见细胞团内出现了不同数量的Pitx2+细胞(图 5)，因此得出结论，抑制BMP4 48 h最有利于mES细胞向口腔外胚层分化。

2.2.4 短暂的外源性BMP4刺激可进一步诱导口腔外胚层细胞向牙上皮细胞分化 48 h后加入30 pmol外源性BMP4刺激，可见第1 组只能见到少量荧光，其余组均有一定的AMBN荧光出现(图 6)。每组随机选取35 个点进行荧光强度分析，结果显示，第3 组AMBN表达明显高于其它组(图 6)。表明短暂的外源性BMP4刺激可促进mES细胞向牙上皮细胞分化。取向纳米纤维支架材料较非取向纳米纤维支架材料更有利于mES细胞向牙上皮细胞分化。

图 3 胚胎干细胞分化过程中形态变化(倒置显微镜)

图 4 外胚层相关基因的表达变化

3 讨 论

本研究经过反复实验，采用多种方式对鼠胚胎干细胞进行体外诱导，通过检测早期外胚层特异性基因及表皮特异性基因，最终摸索出了一套能将鼠胚胎干细胞向牙上皮诱导的方案。用该方案诱导鼠胚胎干细胞，发现表皮特异性基因K14在第3 天表达上调，而早期外胚层特异性基因K18表达在第3 天相对较低，第5 天表达上调。同时在第3 天FGF8表达上调，并伴随着BMP4高表达。这些现象表明第3 天mES开始向K14阳性的角化上皮分化，而第3 天FGF8表达很高，其基因的转录水平与鼠胚胎E 10.5 d的口腔上皮相似。然而不同的是此时BMP4表达亦很高，因此我们向培养基内加入LDN193189，抑制BMP4的功能，从而使FGF8相对处于优势，有利于mES细胞向口腔外胚层分化，口腔外胚层细胞最终分化为成釉细胞。在牙齿发育过程中，牙釉质基质蛋白(Ameloblastin，AMBN),在维持成釉细胞的分化状态中起着至关重要的作用。研究表明在Ameloblastin突变的小鼠中，成釉细胞很快失去极性，增殖，并形成了多个细胞层，最终导致牙釉质发育不全[14]。因此AMBN一直以来被作为成釉细胞分化的特异性标志物。当口腔外胚层细胞成功表达Pitx2后向培养基内加入外源性的BMP4，检测成釉细胞标志性蛋白显示有AMBN表达，表明在合适的时间点先抑制BMP4的功能， 继而在合适的时间点加入外源性BMP4可诱导mES细胞向牙上皮方向分化。

图 5 Pitx2的表达

图 6 AMBN免疫荧光图

可见BMP4在鼠胚胎干细胞向牙上皮细胞分化过程中发挥了重要的作用。经典的Wnt/β-catenin信号途径被认为在牙胚发育过程中发挥着重要作用。当Wnt信号被激活后，可抑制β-catenin的磷酸化，非磷酸化的β-catenin不会被水解并能进入细胞核内，启动相关基因的转录[15-16]。BMP4是影响牙胚发生和发育最关键的因子， BMP4和Wnt信号通路在mES细胞向牙上皮细胞分化过程中参与方式有待于进一步研究。

该培养体系内引入了PLGA纳米纤维，实验结果表明取向性纳米纤维更有利于鼠胚胎干细胞向牙上皮分化，推测可能是取向性纳米纤维更类似于牙胚细胞外基质纤维排列。