黎哲昊 卜歆 封琳 胡君璧 申亮亮 关键

粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)是最常见的原发唾液腺肿瘤，约占恶性唾液腺肿瘤的35%[1-3]。根据形态学和细胞学的特点，可将其分为低、 中、 高3 种分化类型。其中低分化肿瘤极易发生淋巴结和远端转移，五年生存率仅30%[4-5]。明确其发生机制，对于粘液表皮样癌的诊断、预后评估及靶向治疗均具有重要意义。

肿瘤相关中性粒细胞在调控肿瘤生物学行为改变方面发挥重要作用[6-7]。其中，N1型可通过分泌介导T细胞活化等多种方式，发挥抑癌功能；而N2型中性粒细胞可通过分泌金属基质蛋白酶MMP、血管内皮生长因子VEGF等多种细胞因子的方式促进肿瘤的生长、血管发生等过程。本研究探讨了中性粒细胞在调控人粘液表皮样癌上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition, EMT)中的意义，并对其相关机制进行了解读。

1 材料与方法

1.1 材料

MC3细胞由空军军医大学口腔医院建立，是来源于涎腺粘液表皮样癌MEC1的高转移细胞株，培养液为含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液；培养条件为37 ℃、 5% CO2、饱和湿度的孵箱。裸鼠和C57小鼠购自空军军医大学动物实验中心。兔抗人E-cadherin单抗、兔抗人Vimentin单抗、兔抗人TGF-β多抗(Cell Signaling Technology公司，美国)； 小鼠抗人β-actin单抗及Western印迹试剂盒(Sigma公司, 美国)。

1.2 中性粒细胞的分离与培养

利用颈椎脱臼法处死C57小鼠，分离胫骨和股骨，剪掉两端后用稀释液正反冲洗3 次骨髓腔至发白。收集稀释液，利用70 μm尼龙筛网过滤后，转移稀释液至已加入配好小鼠骨髓中性粒细胞分离液(北京索莱宝小鼠骨髓中性粒细胞提取试剂盒)的试管中离心，离心管中出现两层环状乳白色细胞层，用吸管小心吸取分离液中位于下层的中性粒细胞层。加入5 mL 红细胞裂解液去除红细胞，用洗涤液反复3 次，得到中性粒细胞备用。

1.3 细胞侵袭和迁移实验

取对数生长期的MC3细胞并以106个/孔的密度接种至六孔板，待细胞贴壁后，将中性粒细胞以106/孔的密度接种至上层的0.4 μm共培养小室(康宁公司， 美国)。48 h后，收集MC3细胞并以105个/孔的密度接种至8 μm Transwell小室；利用有基质胶包被的小室进行细胞侵袭能力检测，无基质胶包被的小室进行细胞迁移能力检测； 48 h后，将小室细胞甲醛固定并进行结晶紫染色，用显微镜成像。随机取五个视野，通过image J定量，绘制图谱。

1.4 Real-time PCR实验

按上述方式进行共培养实验，待培养48 h后，分别收集上下室的细胞，用TRIzol试剂提取mRNA，用日本TaKaRa公司的PrimeScript real-time PCR 反转录试剂盒进行反转录和real-time PCR。

Vimentin上游引物为5′-AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3′; Vimentin下游引物为5′- CATTTCACGCATCTGGCGTTC-3′； TGF-β上游引物为5′- CTCCCGTGGCTTCTAGTGC-3′； TGF-β下游引物为5′- GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG-3′； Snail上游引物为5′- TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3′； Snail下游引物为5′- AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3′； β-actin上游引物为5′- CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′； β-actin下游引物为5′- CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.5 Western印迹

按上述方式处理细胞并进行共培养实验，收集细胞并加入RIPA裂解液，超声破碎细胞后4 ℃离心，取上清液，收集总蛋白；经10% SDS-PAGE电泳后电转至NC膜；分别行5%脱脂奶粉封闭1 h、 1 ∶1000 稀释的一抗孵育过夜、二抗孵育1 h；通过ECL发光检测结果。

1.6 裸鼠MC3肺转移模型建立

培养荧光素酶表达的MC3细胞，并制备成单细胞悬液，密度107个/ml。将裸鼠固定，于尾部中外1/3处进针，进行尾静脉注射，每只小鼠注射106个细胞。4 周后，给予小鼠腹腔注射荧光素钾盐(150 mg/kg)，并利用活体成像仪显色，观察肺转移瘤的形成与否。

1.7 免疫荧光实验

通过颈椎脱臼法处死小鼠，对肺转移灶取材，4%甲醛固定后，制成石蜡切片，利用抗Ly6G、抗CD11b、抗Vimentin的一抗混合孵育过夜，利用对应的二抗染色，其中Ly6G为红色，CD11b为绿色，Vimentin为粉色。

2 结 果

2.1 肿瘤相关中性粒细胞促进MC3细胞迁移和侵袭

Transwell实验结果显示，与中性粒细胞共培养后的MC3细胞迁移和侵袭能力显著增加(图 1)。结果说明，肿瘤相关中性粒细胞可增强MC3的迁移和侵袭能力。

2.2 肿瘤相关中性粒细胞诱导MC3细胞EMT转变

EMT是肿瘤发生侵袭和转移的关键步骤，经Western印迹和real-time PCR实验检测证明，与中性粒细胞共培养后的MC3细胞中，间质细胞标志分子Vimentin表达升高(图 2)，提示细胞出现间质化的特征。

2.3 肿瘤相关中性粒细胞激活TGF-β-snail通路

基于TGF-β是调控细胞EMT的关键细胞因子，为了验证中性粒细胞诱导MC3发生EMT的机制，我们对肿瘤相关中性粒细胞中TGF-β的表达量进行了检测，Western印迹和real-time PCR实验结果显示，经与MC3细胞共培养后的中性粒细胞中TGF-β的表达量显著增加(图 3A)；而经共培养后的MC3细胞中Snail的表达量也显著增加(图 3B)。

图 1 Transwell实验检测MC3细胞的迁移和侵袭能力(×100)

图 2 肿瘤相关中性粒细胞对Vimentin表达的影响

2.4 肿瘤相关中性粒细胞浸润于MC3转移瘤组织

将带有荧光素酶标记的MC3细胞通过尾静脉注射入裸鼠内，建立MC3肺转移模型,并将组织切片进行免疫荧光染色(图 4A)。其中，Ly6G和CD11b双阳性的细胞为中性粒细胞(橘红)，在中性粒细胞高表达的区域，肿瘤中的Vimentin(粉色)的表达量也显著增加(图 4B)。

3 讨 论

中性粒细胞是固有免疫系统的重要组成部分，在对抗感染和炎症发生的过程中发挥重要作用。近年来人们发现，在肿瘤发生过程中，中性粒细胞也扮演着重要的角色。实体瘤组织中常常伴有中性粒细胞的浸润，其表型和功能具有可塑性，分为N1型和N2型[7]。其中，N1型中性粒细胞在肿瘤发生初期较常见，具有细胞毒性，可激活机体的抗肿瘤免疫过程抑制肿瘤的发生发展，例如，通过活化活性氧(reactive oxygen species，ROS)诱导肿瘤细胞凋亡[8-10]；在集落刺激因子GM-CSF作用下通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)方式杀伤肿瘤[11]。而N2型中性粒细胞常称为肿瘤相关中性粒细胞，常常促进肿瘤的发生发展。目前，人们认识到肿瘤相关中性粒细胞发挥功能的方式主要有以下几种：(1) 分泌前列腺素E2(PGE2)、MMP9促进肿瘤的增殖[12-13]； (2) 分泌释放弹性蛋酶NE、组织蛋白酶G参与对细胞外基质的降解[14-15]； (3) 释放VEGF等促进肿瘤血管的发生[16]。尽管近年来人们对肿瘤相关中性粒细胞的认识逐渐增多，但其如何促进肿瘤的增殖及转移仍有待于深入研究。

图 3 中性粒细胞与MC3细胞的交互影响

A: MC3肺转移小鼠活体成像； B: 肺转移瘤组织免疫荧光染色

EMT是具有极性的上皮细胞失去紧密粘附的能力，运动能力增强，向纺锤样间质细胞的特征转变的过程[17]。EMT过程使得细胞骨架发生改变，细胞具有了更强的移动能力，对个体发育而言，EMT是胚胎期机体组织器官形成的重要途径[17]；而对于肿瘤细胞而言，EMT是肿瘤获得侵袭和转移能力的必经过程[18-19]。细胞粘附分子E-cadherin是上皮细胞的标记分子，对维持细胞上皮样的形态和细胞骨架至关重要，许多研究表明，肿瘤细胞仅通过抑制自身E-cadherin的表达，便能够实现EMT过程的转变[20-21]；此外，间质细胞标记物在EMT过程中表达增加，如波形蛋白Vimentin、钙黏蛋白N-cadherin、纤粘蛋白Fibronectin等。目前，能够直接调控EMT的转录因子家族成员已经逐渐被人们所认识，如Twist、Snail和ZEB等。其中，Snail在影响细胞EMT的过程中地位突出，通过直接调控E-cadherin等分子的表达，诱导细胞EMT过程的发生，并进一步促进肿瘤的侵袭和转移[22]。临床数据显示，Snail的过表达与肺癌、乳腺癌等多类肿瘤的复发和转移相关。Snail作为一个重要的分子标志物，在临床诊断、治疗和预后评估中发挥重要作用[23-24]。

该研究利用粘液表皮样癌模型研究发现，肿瘤相关中性粒细胞可通过促进转化生长因子TGF-β的表达，诱导MC3细胞内Snail的活化，促进细胞EMT过程的发生，导致的肿瘤的侵袭和转移。此外，在动物模型中我们也观察到肺转移的MC3肿瘤周围大量浸润着中性粒细胞，并与Vimentin的表达量呈正相关。

综上，实验均证明肿瘤相关中性粒细胞在诱导粘液表皮样癌EMT、侵袭和转移过程发挥重要作用，为深入理解肿瘤微环境的调控网络提供了实验依据。